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1、实验五 蛋白质的颜色反应及沉淀反应,蛋白质颜色反应原理,蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应。不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦可不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同的颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。,常见的蛋白质颜色反应,米伦氏反应 双缩脲反应 黄色反应 茚三酮反应 乙醛酸反应,（一）米伦氏（Millon）反应,原理：米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞和亚硝酸汞之混合物，能与苯酚、双酚及某些羟苯衍生物产生颜色反应。这些反应最初产生的有色物质可能为羟苯之亚硝基衍生物，
2、经变位作用变成颜色更深的邻醌肟，最终形成红色稳定产物。组成蛋白质的氨基酸中只有酪氨酸为羟苯衍生物，因此该反应为酪氨酸的显色反应（酚羟基反应）。,注意事项：加热时容易产生暴沸，要注意安全，应温和加热。,（二）双缩脲反应,原理：将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故能呈此反应。一般肽键越多颜色越深，而且受蛋白质特异性影响小,注意事项：硫酸铜不能多加，否则会产生影响观察的蓝色络离子Cu(NH3)42+,（三）黄色反应,原理：蛋白质分子中含有苯核结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），遇
3、到硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物。这是含酪氨酸和色氨酸蛋白质所特有的反应。皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸变黄，原因在此。,（四）茚三酮反应,原理：蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及氨基酸所共有。,注意事项：反应必须在pH 5-7进行。,（五）乙醛酸反应含色氨酸的蛋白质在浓硫酸中与一些醛类反应能形成有色物质。此反应可作为色氨酸的定性定量反应。,、在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成、色氨酸的反应（吲哚环的反应）、鉴定蛋白质中是否含有色氨酸,实验步骤,蛋白质沉淀
4、反应原理,在水溶液中蛋白质分子的表面由于形成水化层和双电层，而成为稳定的胶体颗粒。但这种稳定性是有条件的、相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性而丧失稳定因素，即以固态形式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反应。可逆沉淀反应：在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，蛋白质分子内部结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质。除去沉淀因素后，蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。不可逆沉淀反应：在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构，特别是天然结构遭到破坏，失去其天然蛋白质的原来性质，这种蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶剂中。,常见的蛋白质沉淀反应,蛋白质盐析作用 酒精沉淀
5、蛋白质 重金属盐沉淀蛋白质 生物碱试剂沉淀蛋白质 有机酸沉淀蛋白质 无机酸沉淀蛋白质 加热沉淀蛋白质,（一）蛋白质盐析作用原理：向蛋白质溶液中加入中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等）至一定浓度，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度也不同。,注意事项：、应先加蛋白质溶液，然后加饱和硫酸铵溶液；、固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。,（二）酒精沉淀蛋白质原理：酒精为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质点的水化层而使其沉淀析出。,（三）重金属盐沉淀蛋白质原理：当溶液PH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，这样它就容易与重金属盐（如Cu2+、Ag+、Hg2+、Pb2+等
6、）结合形成不溶性盐类而沉淀。,注意事项：使用乙酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时，试剂不可加过量，否则可使沉淀出的蛋白质重新溶解。为什么？,（四）生物碱试剂沉淀蛋白质原理：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂发生反应生成不溶性盐而沉淀。,（五）有机酸沉淀蛋白质原理：当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与某些有机酸如三氯乙酸和磺基水杨酸等的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。这个反应可将生物体液中的蛋白质完全清除。,（六）无机酸沉淀蛋白质原
7、理：浓无机酸（磷酸除外），能使蛋白质发生不可逆的沉淀反应。这种沉淀作用可能是蛋白质颗粒脱水的结果。,（七）加热沉淀蛋白质原理：几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，变成不可逆的不溶状态。盐类和氢离子浓度对蛋白质加热凝固有重要影响。少量盐类促进蛋白质的加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全、最迅速。在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带有正电荷或负电荷，虽加热蛋白质也不凝固。若同时有足量的中性盐存在，则蛋白质可因加热而凝固。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原理可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态。,实验注意事项,实验中使用的试剂种类繁多，注意防止所使用试剂的交叉污染。注意滴管的正确使用，防止酸、碱或有机试剂污染滴头。在实验中，特别是酒精灯加热过程中要注意操作规范，注意实验安全.双缩脲反应时试管口对着墙。除取蛋清液外，其他都用滴管取液,大致估算体积.实验报告中注意解释各种现象和讲义中提出的问题。,思考题,请说出在上述蛋白质沉淀反应中，哪些为可逆沉淀，哪些为不可逆沉淀？,
