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1、第五章 PCR引物设计,研究领域：基因克隆、测序、重组疾病诊断法医鉴定亲子鉴定古生物学研究,PCR技术的应用,PCR及其衍生技术,兼并引物PCRRACE反向PCR（IP-CR）差异展示PCR(DD-PCR)多重PCRTD-PCRPCR-SSCPNet-PCRIC-PCRHotstart PCR SPA,RAPDReal time PCRLD-PCRTall-PCRMarathon PCR原位PCRRT-PCR不对称PCROverlapping PCR.,PCR原理,高温变性低温退火适温延伸,理论上，只要知道任何一段模板序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大
2、量扩增。,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物是PCR特异性反应的关键。,PCR引物,是人工合成的两段寡核苷酸。一个与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。,引物最好在模板cDNA的保守区内设计 保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。同时应预测将扩增的片段单链是否形二级结构。如这个区域单链能形二级结构，就避开它。如这一段不能形二级结构，那就可以在这一区域设计引物。,若不能避开这一区域时，用
3、7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。,1、引物设计的原则,引物要跟模板紧密结合；引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在；引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。,引物设计需要考虑的因素,引物长度（primer length）产物长度（product length）序列Tm值(melting temperature)G值(internal stability)引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）错误引发位点（false priming site）引物及产物GC含量（composition）有时还要
4、对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。,引物设计要点（1）,引物长度:一般，引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp。,PCR产物长度 500bp 引物长度 16 18 bp PCR产物长度 5kb 引物长度 25bp PCR纪录：23bp长度引物 扩增出 40kb产物,引物设计要点（2）,引物3端引物3端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。3端防止连续三个C或G3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，3端不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构可能，扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的
5、第3位?,因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。,引物的5端 引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。,引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。,引物设计要点（3）,引物的Tm值。Tm值最好接近72。过高（72）或过低（37）都不利于引发反应。上下游引物的Tm 不能相差太大。长度为25mer以下的引物：Tm=4(G+C)+2(A+T),对于更长的寡聚核苷酸，Tm
6、=81.5+16.6 x Log10Na+0.41(%GC)600/size 公式中，Size=引物长度。PCR退火温度为Tm-5,计算Tm 值时并不包括5端修饰序列,选用5 端和中间G值相对较高，而3 端G值较低（绝对值不超过9）的引物。G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G值越大，则双链越稳定。G值反映了引物与模板结合的强弱程度,引物设计要点（4）,引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合。因此，5端与中间段的G值应较高，引物3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。,算法：邻近热力学,例：ACGG
7、和其互补 TGCC 结合的G：G(ACGG)=G(AC)+G(CG)+G(GG)=-(1.3+3.6+3.1)=-8.0 kcal/mol,引物设计要点（5）,可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。,错配（或称假引发）：将导致产生非专一产物,引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带，且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。,引物设计要点（6）,1、发夹结构（Hairpin）自身互补 2、二聚体（Dimer）两个引物间互补
8、,对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。,引物设计要点（7）,基因中不能含有任何选择的酶切位点序列酶切位点加在上下游引物的5端保护碱基的设置所有酶切位点都要加上适当的保护碱基，不同的保护碱基切割效率不同。,末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此人为的在酶切位点序列的5端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。,先设计引物，对其退火温度和GC含量评价，完后直接在引物前加上酶切位点就OK了,引物是 5-GGGGGAAAATTTTTCCC CCCTTTTAAATTT-
9、3EcoI 是GAATTC 保护碱基CCGGAATTCCGG 加酶切位点的引物为5-CCGGAATTCGGGGGAAAATTTTTCCC CCCTTTTAAATTT-3,2、引物的自动搜索和评价分析,软件的引物设计功能主要体现在2个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。自动搜索功能以“Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”
10、都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。一般认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。,3、引物设计软件,常用的引物设计软件Primer Premier 5 Oligo 6WONDERFUL生物信息学系统,Primer Premier 5.0的使用技巧简介,引物设计限制性内切酶位点分析motif查找同源性分析功能序列“朗读”DNA与蛋白序列的互换简并引物设计功能,功能：,简并引物：有时需要根据一段氨
11、基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸的遗传密码不只一种，由氨基酸序列反推DNA序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。,简并度的计算：,例如“,Ala Asn Ile Lys Met”的引物 Ala=4,Asn=2,Ile=3,Lys=2,Met=1 4 2 32 1=48,使用步骤及技巧,Preimer Premier 启动界面,复制序列粘贴到此处,进行引物设计时，点击 按钮,如果没有特殊要求，建议使用默认设置。,5对引物,每对产物的大小,引物分值100分为满分,该图分三部分，
12、最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由 变成。,点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。,5加入酶切位点,设计简并引物,Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用
13、的偏好选择1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）3、支原体（Mycoplasma）4、植物线粒体（Plant Mitochondrion）5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）6、一般标准（Standard）7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）,注意事项,(1)选择简并性低的氨基酸区域。,(2)根据生物使用密码子的偏性，选择使用率最高的密码子，进一步限定引物的简并度。,(3)引物的
14、3端不应存在简并。,整体评价,该软件是一款功能全面的引物设计软件，全面地给出了各种参数，并在多个必须的地方给出有效的评价。但是程序在设计中还有一些不足。如：产物的Tm值和引物的Tm值之间的差异也未能给出评价，如果二者差异较大（22度），则容易造成退火时引物-模板和模板-模板火之间的竞争。结果输出方面，只能以图文格式打印，无法转成文本格式,解压密码：在Win.ini中把vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能,Oligo 6.71使用技巧简介,功能 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。其初始界面有3个图：Tm图
15、、G图和Frq图（其中Frq是6.22版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性）。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。,使用,Oligo 6.71的启动界面如下：,G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的G值在5端和中间值比较高，而在3端相对低。Tm值曲线以选取72附近为佳，5到3的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq是邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。Frq曲线揭示了序列片段存在的重复机率大小。该频率高则增加错误引发
16、的可能性。选取引物时，宜选用3端Frq值相对较低的片段。,在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。,当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价。,首先，检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。,第二项检查是发夹结构（hairpin）。一般来说，能值以不超过4.5为好。,第三项检查为GC含量和Tm，以45-55为宜，并且应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近。,如果PCR的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过100为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。,当我们结束以上四项检测，按Alt+P键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。,DNAClub,DNAMAN,
