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1、肿瘤免疫 及其免疫检测 瑞金医院检验科 顾志冬,什么是肿瘤？为什么会发生肿瘤？,肿瘤是正常组织异常增生所形成的赘生物。按其所引起的后果不同可分为恶性和良性两种。,第一节 概述,实践表明，内在的遗传因素、免疫状态和外部的诱变因子，是构成肿瘤发生发展的基础和条件。其中，机体的免疫状态，尤其是细胞免疫功能的强弱，已被视为是否发生肿瘤的重要内在因素。,肿瘤发病率和死亡率,WHO：每年肿瘤死亡人数为630万，至2020年，全世界肿瘤患者将达1500万。我国：恶性肿瘤死亡率为108.39/10万，占死亡 人数17.94%，居死亡原因第二位。肿瘤的早期发现和早期治疗可明显提高患者生 存率。,最普遍的恶性肿瘤
2、死亡原因,临床：病史、体症,物理检查：X光、CT、磁共振、B超、红外、核医学,术前：穿刺、刮片、拉网术后：组织切片,免疫：肿瘤抗原和代谢物测定,分子生物：肿瘤相关基因分析,肿瘤诊断,辅助,病理,正常 间变 恶性 可见前期 不可见前期,物质分析,影像诊断,肿瘤的发展及诊断期,肿瘤的免疫逃避机制？,肿瘤细胞缺乏有效的抗原性表位，难以触发足够的抗肿瘤免疫效应。肿瘤细胞的MHC分子表达发生改变，异常表达的MHC分子，有碍机体免疫细胞对肿瘤细胞的识别，影响抗原递呈作用。不能正常表达B7等活化免疫细胞的共刺激分子和黏附分子。患者血清中存在着封闭因子。肿瘤细胞产生的某些细胞因子对T细胞的产生有抑制作用。肿瘤
3、细胞表达FasL，和活化CTL的Fas结合，介导CTL凋亡。,第一节 概述,体液免疫效应,激活补体的溶细胞作用介导杀伤细胞的细胞毒作用调理吞噬作用干扰肿瘤细胞的生物学行为其他作用,第二节 机体的抗肿瘤免疫效应机制,细胞免疫效应,T细胞 生物学效应包括T细胞的直接杀伤和对免疫系统其它成分的活化。（1）CD4阳性的辅助T细胞（2）CD8阳性的细胞毒T细胞,第二节 机体的抗肿瘤免疫效应机制,CD4阳性的辅助T细胞在胸腺中分为Th1和Th2，其中和肿瘤免疫关系密切的是Th1细胞。激活：肿瘤细胞抗原+抗原递呈细胞（树突状细胞）+MHC II类分子形成复合物，被CD4阳性的T细胞的TCR识别并使自身活化。
4、效应：通过释放细胞因子（TNF，IFN-）发挥抗肿瘤作用。Th表面的CD154分子和APC表面的CD40分子结合，释放IL-12。促进CTL分化和增殖。Th和APC释放共刺激信号分子，协助CTL的分化和增殖。可增强B细胞活化引起的抗体应答及CD8阳性CTL的细胞毒 其亚群可分泌因子促进体液免疫应答。,第二节 机体的抗肿瘤免疫效应机制,CD8阳性的细胞毒T细胞 是肿瘤免疫的主要途径。通过释放毒性物质或促发靶细胞上的死亡受体，而直接溶解靶细胞，或通过分泌IFN-间接杀伤肿瘤细胞，在机体发挥免疫监视的作用。,第二节 机体的抗肿瘤免疫效应机制,细胞免疫效应,NK细胞 NK细胞是宿主固有免疫或一线防御机
5、制的一部分，非MHC限制性，她们不需要对宿主或其免疫功能进行调整适应。对肿瘤细胞和病毒感染细胞比对大多数正常细胞更具有毒性作用。其作用机制类似于CTL，还可分泌大量的细胞因子以调节机体免疫反应。新发现的NKT细胞在胸腺外发育，其发育依赖于TCR与类MHC I类分子CD1的相互作用，经TCR触发，主要介导NK类细胞毒活性。,第二节 机体的抗肿瘤免疫效应机制,细胞免疫效应,巨噬细胞 活化的巨噬细胞与肿瘤细胞的结合可触发细胞毒活性，细胞毒性介质有细胞溶解蛋白酶、TNF-及其相关的因子、IFN-和IFN-、IL-1，氧化反应的中介物如过氧化氢，氮化反应的中介物如NO、精氨酸酶等也可能属于此列。它是参与
6、抗肿瘤、抗感染的主要效应细胞。,第二节 机体的抗肿瘤免疫效应机制,细胞免疫效应,树突状细胞 是一类专职抗原递呈细胞，辅佐T、B细胞参与特异性杀伤肿瘤的过程。可利用制备肿瘤特异性树突状细胞以进行肿瘤的生物疗法。,第二节 机体的抗肿瘤免疫效应机制,肿瘤抗原是细胞癌变过程中所表达的新生物或过量表达产物，它的产生与下列因素有关：细胞发生转化而产生新的蛋白 点突变或基因重组致细胞内癌基因活化，促使表型 改变 随机病变而产生新的蛋白 胚胎抗原的过度表达或分化抗原的异常表达。,第三节 肿瘤抗原的分类,肿瘤特异性抗原 为肿瘤细胞所特有，只表达于肿瘤细胞，而不存在于任何处于不同发育阶段的正常细胞。1.化学物质诱
7、发 其抗原的显著特征是高度个体化，即高度的个体特异性。不同肿瘤，甚至同一化学致癌物诱导的肿瘤，所表达的肿瘤抗原可有不同，而不同化学物质引起的肿瘤，其抗原的差异性更大。,第三节 肿瘤抗原的分类,肿瘤特异性抗原 2.病毒诱发 无严格的特异性，通常由同一种病毒诱发的所有肿瘤，都具有相同的TSA。血清学试验和肿瘤特异性CTL的检测，均有助于抗原的检定。其可诱导机体的免疫应答，故又被称为肿瘤特异性移植抗原。其成分多系病毒基因的表达成分。,第三节 肿瘤抗原的分类,肿瘤特异性抗原 3.自发 自发肿瘤系无明显诱因的肿瘤，很难检测到特异性的抗原标志物，其原因可能有：早期肿瘤细胞及近亲本子代细胞一定时间内可以表达
8、，但后代细胞因为染色体的随机突变而失去表达。可能存在，但单独使用抗原抗体方法难以得到确定答案。,第三节 肿瘤抗原的分类,肿瘤相关抗原 指非肿瘤细胞所特有的抗原成分，也少量存在于正常细胞，但在肿瘤发生的机体可异常表达，可分为胚胎性抗原和分化抗原两种类型。胚胎抗原 分化抗原,第三节 肿瘤抗原的分类,第四节 常见肿瘤的免疫诊断及应用原则,一、肿瘤标志物的检测及临床意义,肿瘤标志物,是显示肿瘤存在的生物化学指示物与肿瘤相伴产生抗原或激素或酶蛋白存在于血液、体液及组织中可定量或定性检测到可以作为辨认和追踪肿瘤存在和发展的标志,肿瘤标志物研究历史,1845 Bence-Jones 本周蛋白 1930 Zo
9、ndek HCG1959 Markert 同工酶 1963 Abelev AFP1965 Gold&Freeman CEA1969 Hubner&Todaro 癌基因1975 Kohler&Milstein 单克隆抗体1978 Herberman 提出肿瘤标志物概念1979 英国第7届肿瘤发生生物学和医学会议 肿瘤标志物被确认并应用临床1980 Koprowski CA19-91981 Bast et al CA1251981 Colcher et al CA72-41984 Kufe et al CA15-3.,已建立的肿瘤标志物,肿瘤标志物的分类,细胞肿瘤标志物：位于细胞中的物质或抗原，如
10、激素受体、白血病表型。体液肿瘤标志物：病理情况下，浓度增加时可在血液、尿液或其他体液中测得的物质，如AFP、CA19-9、CEA、CA15-3等。肿瘤表型标志物：酶、胚胎性抗原、异位性蛋白、激素等。出现于癌细胞转化和临床进展阶段。肿瘤基因标志物：基因突变、基因表达异常等，出现于癌前起动阶段。,在各种肝病中AFP的变化,AFP在各类肝病中的阳性率,AFP阳性后查找肝癌,肿瘤直径 五年生存率 5 cm 31.25%10cm 3.7%,癌胚抗原,一.正常值(直接法 ng/mL),胸，腹水 10ng/mL,二.病理值(直接法 ng/mL),一)病种：阳性检出率(Ca)1.胰、胆 肠、胃 泌尿、乳房 6
11、080%5060%2030%,胰、胆、肠、胃、肺炎症等良性病变一般不 25 ng/mL,癌胚抗原,二.病理值(直接法 ng/mL),2.胸腹水阳性率高于血液3.AFP，CEA联合检测鉴别原发/继发肝癌,总PSA和游离PSA,PSA的两种主要形式,游离PSA,结合PSA(PSA-ACT)-1-antichymotrypsin,抗原结合部位,PSA,PSA,ACT,PSA的检测,PSA66MAb,PSA10 MAb,35%,30%,25%,20%,15%,10%,5%,0%,良性疾病的可能性增加,前列腺癌的可能性增加,FREE PSA%结果解释,前列腺癌的可能性%,CI*Confidence In
12、terval,糖类抗原12-5（CA125）是卵巢癌和子宫内膜癌的肿瘤标志物分子量为20万的糖蛋白可被单克隆抗体OC125所识别在卵巢肿瘤上皮和Mullerian副肾管来 源的病理和正常组织中表达，其生物 学功能不明。,糖类抗原12-5（CA125）,正常人血清中CA125的临界值为35U/ml CA125的半衰期仅4.8天，在血中很快代谢，所测即时结果能反映肿瘤近期的变化状态,CA125在卵巢癌，尤其是上皮性卵巢 癌、子宫内膜癌可出现升高，还可在 肺癌、宫颈癌等肿瘤状态时升高。CA125在子宫内膜异位症、1%的健 康妇女、3%的患良性卵巢疾病妇女 及其他非肿瘤患者也可见到升高。,CA125的
13、临床应用,卵巢癌的辅助诊断观察病情及预测预后-血清CA125升高（或降低）2倍的患者 中大于80%的病例为病情进展（或消退）-CA12535U/ml的病人中有95%在第二次 手术时仍有肿瘤存在,早期复发的监测75%的患者在肿瘤复发前一年左右时间CA125的水平就已升高,CA125的临床应用,CA125升高：90%的卵巢癌和期 50%的期和90%的期CA125升高水平与肿瘤大小和分期有关CA125可以区别可触及的良性或恶性实体瘤,CA125的临床应用,卵巢癌和良性卵巢疾病的鉴别诊断连续测定CA125联合检测CA199可提高准确性，敏感性可从83.3%提高到91.6%卵巢上皮性癌患者CA125明显
14、高于对照组，敏感性可达82%到93.5%8%的良性患者CA125大于65U/ml，而恶性患者占75%,CA125的临床意义,术后 CA125 的升高是癌肿复发的重要标志，当CA125大于65U/ml时则不需作第二次手术探查,CA125的临床应用,糖类抗原19-9（CA199）CA19-9是胰腺、胃和肠癌的标记物。正常人群血清CA19-9阳性的临界值为 37U/ml,癌组织中的浓度要高于正常组织或 炎性组织；是胰腺癌诊断较好的指 标，还可用于胃肠癌的检测和筛选。伴有黄疸的良性疾病患者也可出现 CA19-9升高，但一般不120/ml，经临床处理后可恢复到正常值范围。,CA19-9的临床应用,诊断-
15、可以作为胰腺和胆管癌较好的标志物用于临床，胰腺癌的阳性率可达70%92%，胆管癌为66.7%-对胃癌、肝癌和结直肠癌的阳性率分别可达25%60%、56%60%，18%58%,疗效监测 治疗中及术后含量下降乃至正常表示治疗方案正确复发跟踪 升高可作为肿瘤复发转移的亚临床诊断或重要的辅助诊断指标,CA19-9水平在胰腺癌诊断中反应参数的比较,神经原特异性烯醇化酶（NSE）,同功酶类肿瘤标志物，正常仅存于神 经组织和红细胞中正常人血清值为 13g/L小细胞肺癌、神经母细胞瘤和神经内 分泌肿瘤及脑损伤时升高待测标本绝对禁止溶血，溶血可出现 NSE血清水平升高,NSE的临床意义,NSE在小细胞肺癌中的阳
16、性率明显高于对照组，NSE可作为小细胞肺癌的高特异、高灵敏的肿瘤标志物,跟踪监测癌肿病情进展和疗效判断-肺癌 NSE高于11.8 g/L预示肺癌患者生存 期较短 化疗24小时后 NSE下降是治疗效果良 好的标志,其他癌症癌症复发的早期标志，尤其是存在胸腔、肝、骨骼、脑、脊髓转移NSE升高的癌症患者5年存活率仅为5%12%,NSE的临床应用,肿瘤标志物对分型的比较,阳性率,Ebert,W.,et al.Anticancer Research,1996,16:2161-2168,人绒毛膜促性腺激素（HCG）,糖蛋白类激素，由蛋白核心与位于 羧基端的以唾液酸为终止的侧链组成两个亚基组成:&:与-LH
17、,TSH 和 FSH相同:与-LH有交叉由合胞体滋养层细胞产生 被证实是一种原始物质(可作为一种有用的肿瘤标志物),hCG Epitopes,Intact hCG,Free,Free,Free-hCG Assay,Catching Antibody,Detecting Antibody,HCG,临床应用：HCG上升：几乎所有绒毛膜上皮细胞 癌、70%的非精原细胞性睾丸癌，胃 肠道、肺、乳腺肿瘤时亦可见HCG水平与肿瘤大小、疾病预后有关脑脊液中HCG上升提示肿瘤有脑转移可用于监测治疗,第四节 常见肿瘤的免疫诊断及应用原则,二、常见肿瘤标志物检测的免疫方法,标记免疫方法,HAPATITIS,CAN
18、CER,FERTILITY,PROTEINS,TDMs/DRUGS,TYROID,ANEMIA,HBVHCV,M107,10,10-15,10-4 g/L,AFP FERCEA CA199,PRLHCG LH FSHGH Myoglobin,RHF IgGC3 ASO CERTRF AAG,QUI GEN AMI PHY,FT3 FT4 Dig T3 T4TSH Prog,Immunoassay Analyte Map,待测物质浓度与检测手段,临床化学分析,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs,Thyroid Hormone,Fe
19、rtility Hormone,Allergy,Cancer Markers,Infectious Disease,Vitamins,Serum Proteins,第四节 常见肿瘤的免疫诊断及应用原则,三、肿瘤标志物的应用价值,肿瘤标志物的应用价值,普查定位辅助诊断分期疗效监测预后预测,普查,一般不适宜对无症状人群进行普查CEA查结肠癌 普查 在消化病房使用,发病率 370/10万 10000/10万灵敏度 95%95%特异性 70%70%真阳性数 370*95%=351.5 10000*95%=9500假阴性数 370-351.5=18.5 10000-9500=500真阴性数 99648.
20、5*70%=69753.95 90000*70%=63000假阳性数 99648.5-69753.95=29894.55 90000-63000=27000阳性预示值 0.15%26.03%阴性预示值 99.97%99.22%,肿瘤标志物普查五项原则,应十分清楚该肿瘤的发病率该肿瘤标志物应能检测早期肿瘤该肿瘤的早期治疗比晚期治疗更经济有效测定方法的灵敏度、特异性和重复性良好普查所需费用能被接受,定 位,肿瘤标志物基本上不能对肿瘤定位。极少数肿瘤标志物如PSA，PAP，甲状腺球蛋白具器官特异性，但不具肿瘤特异性。,确 诊,通常不能进行确诊。因为肿瘤标志物无足够的灵敏度，不能 排除假阴性结果。本周
21、蛋白(多发性骨髓瘤）、AFP（肝 癌）、-HCG（绒毛膜癌）和降钙素（甲状腺C-细胞癌）等有助确诊。,分 期,大多数肿瘤标志物与疾病分期有关，且浓度与肿瘤大小通常存在关联。但并不能根据个体测得值来判断肿瘤大小，也不能以肿瘤标志物浓度精确指示各期肿瘤，因为各期肿瘤的肿瘤标志物浓度范围极广，且互相重叠。,肿瘤标志物评价治疗有效性方案(Beastall,1991),无效：浓度与治疗前相比下降50%有效：浓度与治疗前相比下降90%,预 后,术前浓度增高，术后降低，表示这些肿瘤标志物对此肿瘤有预后价值。在病程监测过程中，肿瘤标志物的浓度增高或降低与疾病的预后密切相关。,术后肿瘤标志物水平的变化,73,肿
22、瘤标志物水平,跟 踪 复 发,预 测,利用ROC曲线进行PPV：阳性时患肿瘤的可能性NPV：阴性时不患肿瘤的可能性PPV和NPV与灵敏度、特异性和患病率有关肿瘤标志物的灵敏度、特异性、PPV、NPV 不是固定不变的，而是依赖于选定的临界值。,肿瘤标志物的临床应用,1.预后：病员分群(-)非保护人群(+)保护人群-预后好、坏,2.疗效观察：外科：手术切除/残留/姑息 保守：药效、放疗效果3.随访：术后6周 三年 五年 七年 4.良/恶鉴别：辅助指标,标志物,三月一次,半年一次,一年一次,肿瘤标志物的应用原则,1.有关标志物联合检测-提高灵敏度2.阳性标志物动态观察-提高准确性 不应以单项、单次检
23、测下诊断,肿瘤标志物的其它几个问题,正常参考范围的界定方法学不同而导致的结果的不统一,肿瘤标志物的正常参考范围,目前通常以正常人群的95%的可信区间为正常参考范围，对于肿瘤标志物，由于双侧通常是无意义的，因此一般取右单侧 95%为正常参考范围。即有5%的正常人在检测时其值会超过正常参考范围，引起临床的假阳性结果。,正常参考范围的建立 正常人群的平均值2SD,2.5,97.5,肿瘤标志物的正常参考范围,研究表明，正常参考范围对于肿瘤标志物来讲是毫无意义的，我们希望通过检测值来了解：（1）阳性结果提示该病人罹患肿瘤的概率（2）阴性结果提示该病人不罹患肿瘤的概率,最后通过概率的大小来指导临床应该进行
24、的检查和处理措施，因此应用ROC曲线（receiver operator characteristic curve)来确定最佳界定值（cutoff value）。,临 界 值 的 确定,根据金标准确定病人和对照两组例数相似的人群，并测出各组的实验数据。用该实验数据的不同域值区分阳性和阴性的不同分界点，分别计算灵敏度和特异性。绘制ROC曲线，最接近左上角的点即为最佳临界值，其灵敏度最高，特异性最强。,ROC曲线,良好的肿瘤标志物特异性应为95%，并以此值来考虑灵敏度。如果几种标志物对某一肿瘤具有大致相当的灵敏度，应选择特异性最高的标志物。如果考虑良性疾病肿瘤标志物升高的因素，而特异性保持不变，应
25、将临界值略为提高，即设置边界区（borderline zone)，如肿瘤标志物在边界区内，应进一步明确诊断。,临界值应根据需要确定,选择临界值不能同时提高灵敏度和特异性。将临界值提高，特异性增加但灵敏度降低。将临界值降低，灵敏度提高但特异性下降。体检时应选择较高的灵敏度，将有问题的人 尽量多地检出；确诊时应选择较高的特异性，去除假阳性结果。,第四节 常见肿瘤的免疫诊断及应用原则,四、肿瘤标志物的联合检测肺癌：NSE、CYFRA21-1、CEA乳腺癌：CA153、CEA肝癌：AFP、AFU、CEA、AKP同工酶胰腺癌：CA242、CA199、CA50卵巢癌：CA125、CEA、CA199、HCG
26、联合应用可大大提高检出的灵敏度,第五节 肿瘤的免疫治疗,1984年，美国国立卫生研究院正式把肿瘤生物治疗和外科手术、放射疗法和化学疗法一起作为治疗肿瘤主要疗法之一。肿瘤免疫治疗的目的是通过增加肿瘤细胞的免疫原性或激发、调动宿主的免疫系统抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。临床上先用常规疗法清除大部分肿瘤细胞，再使用生物学治疗方式清除、杀伤少量的残留或扩散的肿瘤细胞，以提高、巩固肿瘤治疗的效果，减少肿瘤的复发。,第五节 肿瘤的免疫治疗,一、主动免疫疗法（肿瘤疫苗）肿瘤细胞疫苗肿瘤抗原疫苗病毒疫苗DNA疫苗抗原递呈细胞疫苗,第五节 肿瘤的免疫治疗,二、免疫导向疗法三、过继免疫疗法四、细胞因子疗法五、基因疗法,总结,免疫与肿瘤的关系肿瘤的抗原性免疫学检验免疫功能状态的评估免疫治疗,谢 谢,
