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1、第一章 蛋白质,第一节 蛋白质在生命活动中的重要性一、蛋白质功能的多样性 催化功能；传递功能；免疫功能；受体；激素；二、蛋白质中的元素组成,三、蛋白质的特征元素-氮 含氮量较恒定，一般在16%左右 蛋白质系数6.25 蛋白质含量=样品含氮量6.25,第二节 蛋白质的基本结构单位-氨基酸,非蛋白氨基酸（二百余种）,氨基酸,蛋白氨基酸,基本氨基酸,稀有氨基酸,一、结构特点与分类,1.结构特点：所有20 种基本氨基酸的结构通式,特点：-氨基酸(脯氨酸除外)L-氨基酸（甘氨酸除外）,中文：如 丙氨酸；英文：三字母符号（Ala）和单字母符号（A）,2.分类 根据各氨基酸R基的带电性 将20种氨基酸共分为
2、四组：非极性R基氨基酸 极性不带电荷R基氨基酸 带负电荷R基氨基酸（酸性氨基酸）带正电荷R基氨基酸（碱性氨基酸）,表示：,3.稀有氨基酸：蛋白质合成后经加工修饰而生成的氨基酸。,4羟基脯氨酸,赖氨酸,5羟基赖氨酸,二、必需氨基酸（8种）：人体不能自我合成，必须从外界中摄取的氨基酸,赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、色氨酸,氨基酸丙氨酸缬氨酸亮氨酸异亮氨酸苯丙氨酸色氨酸甲硫氨酸脯氨酸,三字母 符号 Ala Val Leu Ile Phe Trp Met Pro,单字母符号 A V L I F W M P,非 极 性 R 基 氨 基 酸,结构式,三、氨基酸的理化性质,1
3、.一般性质：溶解度：可溶于水、稀酸、稀碱中 旋光性：丙氨酸+1.8、半胱氨酸-16.5、脯氨酸-86.0 熔点：大部分在200以上，丙氨酸297、丝氨酸2802.两性解离和等电点：氨基酸由酸性基团和碱性基团，可以发生两性解离：,等电点定义：某一氨基酸的净电荷等于零时的溶液pH值为该氨基酸的等电点不同的氨基酸有不同的等电点等电点时的特点：溶解度下降用途：可根据氨基酸的等电点来分离不同氨基酸，如味精生产时将pH值调到3.22，谷氨酸沉淀下来。,pI 计算法：pI=（pK左+pK右）/2 pK左:pI处左侧pK 值，pK右:pI处右侧pK 值。如：甘氨酸的两性解离为：,pK1=2.34 pk2=9.
4、60 pI=(2.34+9.60)/2=5.97,赖氨酸的两性解离为：,与等电点有关的pK值为：pK2=8.95 pK3=10.53 pI=9.74 一、二、三组氨基酸：pI=（pK1+pK2）/2 第四组氨基酸：pI=（pK2+pK3）/2,吸收光谱 所有20种基本氨基酸在可见光区都无光吸收，在近紫外区三种芳香氨基酸具有紫外吸收，即：苯丙氨酸257nm 酪氨酸275nm 色氨酸280nm,氨基酸表观解离常数和等电点,用途：可用于氨基酸的定性和定量测定 脯氨酸是亚氨基酸，只有一步反应，反应产物为黄色。,4.氨基酸的重要化学反应（1）茚三酮反应,（2）Sanger反应 氨基酸与二硝基氟苯（DNF
5、B）反应，生成二硝基苯代氨基酸（DNP氨基酸）,用途：测定肽链N-端氨基酸,（3）Edman反应 异硫氰酸苯酯与氨基酸反应生成PTH氨基酸,用途：蛋白质一级结构序列测定,离子交换剂,配对离子,氨基酸,平衡离子,5.氨基酸的分离方法 离子交换层析,第三节 肽,一、概念,二、书写方式 左右，N C，可用英文或中文简写，中间用一短杠相连，氨基端加“H”，羧基端加“OH”，每一个氨基酸要叫氨基酸残基。例：H-丙-甘-谷-精苯丙-组-OH H-Ala-Gly-Glu-ArgPhe-His-OH,主肽链 多肽链中由共价键连接成的连续的链状结构 肽单位 主肽链中的重复单位,由于有巯基，所以有氧化还原反应 G
6、SH+GSH GSSG+2H+2e-谷胱甘肽是生物体内重要的氧化还原物质，对细胞起到了保护作用，另外，还是其他细胞保护剂的还原剂,三、重要的寡肽及其作用 谷胱甘肽（GSH）：,第四节 蛋白质结构,一、一级结构：定义：蛋白质的多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键位置 特点：基础结构，稳定结构 牛胰岛素的一级结构（局部）：牛胰岛素由A、B两条肽链组成，A链20个氨基酸残基，B链30个氨基酸残基,二、二级结构：（1）概念：二级结构定义在规则氢键指导下局部多肽链在空间的排列方式 由于单键可以自由旋转，所以从理论上说肽链有无数种构象，但实际上，蛋白质的二级结构只有少数几种，这是由于肽链在形成空间结构时要
7、受到多种因素的限制，这些因素有：,肽键平面由于肽键的双键性质，使得形成肽键的N、C原子以及它们相连的四个原子形成一个平面，这个平面就叫肽键平面。,形成的原因：p共轭，肽键不能自由旋转 结果：形成刚性平面,二面角 和两个构象角称为二面角,要点：单链右旋一圈3.6残基上升0.54nm形成51氢键且全部平行R基指向外侧,（2）种类（4类）,a螺旋：,折叠：要点：肽链伸展，形成链间氢键（成为片层），R-基处于片层上下,反平行b折叠,折叠有平行和反平行两种,转角（回折）：肽链180旋转，氢键连接；,无规则卷曲,转角,三、超二级结构：概念：相邻二级结构单元 相互作用形成的聚合体,种类：（A）X(B、C)曲
8、折（D）回形拓扑结构(E),四、结构域,乳酸脱氢酶结构域,刀豆蛋白结构域,弹性蛋白酶三级结构与结构域,免疫球蛋白G,如：卵溶菌酶 一条肽链，124个氨基酸残基，分子量为14600,五、三级结构：定义：蛋白质分子中所有原子的空间排列,肌红蛋白 是肌肉中运输氧的蛋白质，一条肽链，153个氨基酸残基，分子量为16700，含一个血红素辅基，氧分子就结合在它的铁上。整个分子有8个-螺旋，并且有-转角和无规则卷曲，但是无-折叠。,三级结构特征：高低不平,IgG的结构,疏密不一近似球状,醛糖脱氢酶,外亲内疏,如：血红蛋白含有四个亚基，为22，每个亚基含一个血红素，每个血红素可结合一个氧分子。亚基含141个氨
9、基酸残基，亚基含146个氨基酸残基。,六、四级结构：概念：蛋白质分子中亚基在空间的排列,Hemoglobin空间结构,四级结构的结构特点-对称性,四级结构的优越性：,氢键、盐键、疏水作用力、二硫键、配位键、范德华引力,七、维持蛋白质空间结构的作用力,一、一级结构与功能的关系：一级结构与功能有密切的关系1.氨基酸对功能的重要性 如果改变的氨基酸是蛋白质执行功能所必需的，则这种氨基酸的改变对功能的影响极大，如果改变的氨基酸对功能无贡献，则它们的改变基本不影响蛋白质的功能。如RNA酶，如果将其N-端的三个氨基酸去掉，酶的功能基本不变，但是，如果将组12改变，则酶失去活性。,第五节 结构与功能的关系,
10、镰刀状贫血病：就是由于血红蛋白-链上第六位的谷氨酸被缬氨酸代替，使得血红蛋白分子在氧分压低的情况下容易聚合，形成杆状多聚体，致使红细胞由正常的圆盘状成为镰刀状，血液流动受到阻碍。,同源蛋白：不同生物中具有同一功能的蛋白质。它们的特点是其一级结构中，与功能直接相关的残基相同，而其它残基有差异，这些残基是可以改变的，这种变化往往与生物进化有关。例：Cytc与进化生 物 残基改变数 生 物 残基改变数 生 物 残基改变数黑猩猩 0 狗 11 狗鱼 23恒河猴 1 骡 11 蛾 31兔 9 马 12 小麦 35袋鼠 10 鸡、火鸡 13 面包霉 43鲸 10 响尾蛇 14 酵母 44牛、猪、羊 10
11、韧齿龟 15,2.种属差异与分子进化,一定的结构，一定的功能,结构变化，功能变化,结构破坏，功能破坏,二、空间结构与功能的关系,第六节 蛋白质的理化性质 一、两性解离与等电点：,概念：蛋白质净电荷等于零时的环境pH值。不同蛋白质其等电点不同：胃蛋白酶：1.02.5；胰岛素：5.35.35；血红蛋白：7.07；鱼精蛋白：12.012.4特点：溶解度降低，可用于蛋白质的分离电泳：大分子化合物在电场中运动的过程。原理：不同蛋白的电荷正负和数量不同，分子量不同，形状不同，因此在电场中的运动速度不同。方向与速度的鉴别：pI pH，正负为方向，数值为速度。用途：分离鉴定蛋白质等大分子化合物,根据载体的不同
12、，电泳有膜电泳、凝胶电泳等如：人血清蛋白的醋酸纤维膜电泳图谱。,现有一混合蛋白质样品，内含A、B、C、D三种蛋白，其等电点分别为：A 10.8 B 7.5 C 5.6 D 3.2，指出在pH7.5的缓冲液中电泳时，它们各自的位置。根据pI pH，结果为：A 10.8 7.5=3.3 B 7.5 7.5=0 C5.6 7.5=1.9 D 3.2 7.5=4.3它们电泳后的位置为：,凝胶电泳,例题,蛋白质分子量小的几万，大的可达几百万，其大小为1100nm，已经达到胶体质点的范围，同时，蛋白质分子外表为亲水表面，所以，蛋白质属于亲水胶体，并且是稳定的胶体。稳定因素：水化膜，同种电荷,+,二、胶体性
13、质,+,但是稳定是相对的，如果改变条件其稳定性就会发生变化，如加入有机溶剂则会脱去水化膜，改变p就会改变其电荷。,透析：大分子化合物不能通过半透膜的性，可用于蛋白质脱盐,沉降：在强离心场中，大分子化合物向离心力方向移动的现象,沉降系数（s）：单位离心场强单位时间内蛋白质的沉降距离，其单位是S（注意s与S的区别），如某蛋白的沉降系数为70，则表示为70S。蛋白质S值的大小可以近似表示蛋白质分子量的相对大小。,三、变性,概念：物理化学因素影响，空间结构破坏，性质改变，功能丧失,核糖核酸酶的变性过程,因素：物理：热、高能射线，振动；化学：强酸、强碱、变性剂。原因：空间结构破坏。性质改变：溶解度下降，
14、反应活性改变。标志：生物活性丧失,盐析：高浓度中性盐使蛋白质沉淀的现象原因：破坏了稳定胶体的两个因素,四、沉淀：,静电荷为零,优点：不影响蛋白质的空间结构，常用于蛋白质分离常用的盐类：硫酸铵和氯化钠盐溶：低浓度中性盐使蛋白质溶解度增加的现象变性沉淀；沉淀剂沉淀：有机溶剂、重金属盐、某些酸类，如苦味酸、三氯乙酸；相互沉淀,280nm，由于有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸,可用于蛋白质含量的测定六 呈色反应：茚三酮反应 双缩脲反应：可用于蛋白质含量的测定（540nm）,五 紫外吸收：,一、蛋白质分离纯化的依据,大小（大小从几百到一百万。一般10,000150,000）形状（球型、雪茄型蛋白在电泳、梯度离
15、心、层析时摩擦阻力、扩散速度不同）电荷（天冬氨酸、谷氨酸占优势，pH=7时带负电荷，为酸性蛋白；赖氨酸、和精氨酸残基占优势，pH=7时带正电荷，为碱性蛋白）等电点（蛋白质等电点一般为4.0-10.0之间）电荷分布（荷电残基不均匀分布或成簇分布时往往能以适当的强度与阴阳两种离子交换树脂作用）,第七节 蛋白质的分离纯化,疏水性（多数疏水性氨基酸蚕基藏在蛋白内部，但也有一些见于表面。盐浓度增大时往往露出疏水表面）溶解度（溶解度从基本不溶300mg/ml,pH、离子强度、离子的性质、温度、溶液极性等影响溶解度）密度（富含磷酸盐蛋白高密度1.8mg/ml，脂质部分密度1.03，可梯度离心）配体结合能力(
16、酶与底物、效应分子、辅助因子、和DNA模板结合)金属结合能力(胱氨酸、组氨酸残基与Cu2+、Zn2+、Ca2+、Co2+、Ni2+二价金属离子结合),可逆性缔合(蛋白二聚体、三聚体等的可逆变化)翻译后修饰(翻译后加入糖基、酰基、磷酸基团等。糖基与外源凝集素柱子结合，磷蛋白在某些糖基存在下与二价Fe离子)特异性序列或结构(氨基酸残基在蛋白质表面上的精确的几何表象可用来作为分离方法的基础。如免疫亲和层析)基因工程构建的纯化标志(改变cDNA而在被表达的蛋白氨基端或羧基端加几个额外的氨基酸，如6个组氨酸与Ni2+螯合)其它非寻常性质(某些蛋白质还有一些不同寻常的性质，如热稳定性、抗蛋白酶解等，结合二
17、者用来纯化酶等。因大多数蛋白95C时解折叠并凝结或沉淀),二、蛋白质分离纯化的一般程序 破碎生物组织并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来分离亚细胞颗粒(离心法)蛋白质组分粗分离(盐析法、有机溶剂法等)蛋白质组分的细分离（层析法、电泳法等）在适当条件下使蛋白质结晶或制成冻干粉。,（原料是细胞分泌物时无需此步），,如核、线粒体、微粒体或核糖体）及细胞碎片与溶液分开,三、蛋白质的分离纯化方法 1.溶解度不同：等电点，有机溶剂，盐析 2.电荷不同：电泳，离子交换（纤维素）,离心，透析，凝胶过滤（凝胶结构为立体网状，蛋白质分子量大的先被分出，小的后被分出）,3.分子形状大小不同,一、根据溶解度与组成（一）简单蛋白：清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白（二）结合蛋白：色蛋白、核蛋白、磷蛋白、脂蛋白、糖蛋白等二、根据形状与位置 球状蛋白、纤维状蛋白、膜蛋白,第八节 蛋白质的分类,
