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1、第十章 微生物的分类和鉴定,第一节 通用分类单元第二节 微生物在生物界的地位第三节 微生物分类鉴定的方法,微生物分类学（Microbial taxonomy）是一门按微生物的亲缘关系，把其安排成条理清楚的各种各类单元或分类群的科学,包括分类（Classification）、鉴定（Identification）、命名（Nomenclature）,第一节 通用分类单元,一 种以上的系统分类单元二 学名三 亚种以下的几个分类名词,一、种以上的系统分类单元（一）七级分类单元：界（Kingdom）、门（Phylum）、纲（Class）、目（Order）、科（Family）、属（Genus）、种（Spec
2、ies）（二）种的概念：具体的种应具有相同的祖先和相同或相似的形态、生理特征，在特定的环境条件下具有相对的稳定性和一定范围内的变异性。一个种只能用该种中的一个典型菌株作为具体代表,称为模式种或是模式标本,群：grow series E.Scherichia coli 与 Aerobacter 归为Coliform group。两种以上及其过渡类型分归为一个群（一组具有相同性状的生物）变种(Variety)：发生变化了的种称为变种，具有典型的不同特征，且可以稳定遗传。如Bacillus Subtilis Var asporous,二、学名（一）微生物通常采用双命名法。学名有属名和种名加词构成,用
3、斜体表示。属名在前,而且第一个字母大写,种名在后,全部小写。学名可以附上首个命名者的名字、现名定名人和现名的定名时间。学名=属名+种名加词+首次定名人+现名定名人+现名定名年份,如:Staphylococcus aureus Rosenbach 1884（金黄色葡萄球菌）Escherichia coli（Migula）Castellani et Chalmers 1919（大肠埃希氏菌）Clostridium acetobutylicum Mccoy，Fred，Peterson et Hastings 1926（丙酮丁醇梭菌）,（二）三名法 当某微生物是一个亚种（subspecies 简称“s
4、ubsp”）或变种（variety 简称“var”）时，学名就应按三名法拼写。学名=属名+种名加词+subsp（var）+亚种（变种）的加词 如：Bacillus thuringiensis（subsp）galleria（苏云金芽孢杆菌醋螟亚种）Saccharomyces cerevisiae（var）ellipsoideus（酿酒酵母椭圆变种）,三、亚种以下的几个分类名词,亚种：指除某一明显稳定的特征外，其余鉴定特征都与模式种相同的种。变种：亚种的同义词。型：曾用做菌株的同义词，仅用做若干型的后缀，如生物变异型、形态变异型、致病变异型及血清变异型等菌株：又称品系，表示任何由一个独立分离的单细
5、胞繁殖而成的纯遗传型群体及其一切后代。,第二节 微生物在生物界的地位,一 生物的界级分类学说二 三域学说及其发展,一 生物的界级分类学说两界系统：植物界和动物界三界系统：增加第三界原生生物界四界系统：植物界、动物界、原始生物界（原生动物、真菌、部分藻类等）及菌界（细菌、蓝细菌等）三总界五界系统,五界系统：包括动物界、植物界、原生生物界（原生动物、单细胞藻类及粘菌等）、真菌界和原核生物界。,纵向显示从原核生物向真核单细胞生物再向真核多细胞生物的三个近化阶段；横向则显示光合式营养、吸收营养和摄食营养三大进化方向。,六界系统后生动物界、后生植物界、真菌界、原生生物界、原核生物界和病毒界等,二 三域学
6、说及其发展,三个域指的是细菌域、古生菌域和真核生物域等,第四节 微生物分类鉴定的方法,一 微生物分类鉴定中的经典方法二 微生物分类鉴定中的现代方法,一 微生物分类鉴定中的经典方法一）经典的微生物鉴定指标 1、形态特征：1）群体形态特征：菌落的形态、在半固体培养基或液体培养基中的生长状态。2）个体特征：显微镜观察其形态或是染色后再观察，包括细胞形状、大小、排列形式、运动性、特殊构造和染色反应等。,2、生理生化特征：,1）对营养的要求：如能源、碳源、氮源、生长因子等的要求。2）代谢反应（酶）：水解大分子的能力（淀粉、油脂、明胶等）、分解糖或醇类产酸和产气、硝酸盐还原试验等。3）代谢产物：包括产物的
7、种类和数量等，通过颜色和显色反应等检测。4）抗逆性试验：对包括温度、pH、药物等的抗性。,3、生态特征：微生物与溶解氧的关系、对温度、渗透压、盐度及pH等的要求、与其他生物之间的相互关系等。4、生活史：繁殖方式、生长周期等5、抗原特征：通过血清学反应检测。6、对噬菌体的敏感性7、其他：氨基酸顺序 蛋白质分析 细胞壁等细胞成分分析,生理生化特征,在以实用为主要目的表型分类中，生理生化特征往往是细菌分类鉴定的主要特征。肠道菌科细菌属和种的分类鉴定就是如此。,肠杆菌,柠檬酸杆菌,沙门氏菌,志贺氏菌,二）微生物的微型、简便、快速或自动化鉴定技术。1 API细菌数值鉴定系统：同时鉴定20项以上生化指标，
8、因而可用作为快速鉴定细菌。一种长形卡片，其上整齐地排列着20个小塑料管，其中加有适量糖类等生化反应底物的干粉和反应产物的显色剂。,API 细菌数值鉴定系统,适用于API鉴定细菌有700多种,菌悬液,菌种,基本培养基（液体）,检测、编码、查表、鉴定,2 Enterotube系统 又称肠管系统。一种用一条有812个分隔小室的划艇形塑料管制成，面上有塑料膜覆盖，可防止杂菌污染。每个小室中装有鉴定不同生化反应的固体培养基，通过将小室中的金属丝接触菌落，从对侧将金属丝拉出以接种。,3 Biolog全自动和手动细菌鉴定系统 适用于动植物检疫，临床和兽医的检验，食品、饮用水卫生的监控、药物生产等。关键部件为
9、一块有96孔的细菌培养板，其中95孔中各加有氧化还原指示剂和不同的发酵性碳源的培养基干粉，另一孔为清水对照。鉴定前，将待检纯种微生物制成适当浓度的悬液，接种于96孔中，于37培养424h，将培养板放进检查室用分光光度计检测，再通过计算机统计即可计算该菌株属于何种微生物。,Biolog全自动或手动细菌鉴定系统,在96孔的细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源利用情况进行的分类鉴定。,可鉴定细菌有1140多种、酵母菌267种、目前已经可用于丝状真菌。,每个孔中含有不同的底物,菌悬液或无菌水,自动化、快速,二 微生物分类鉴定中的现代方法,（一）通过核酸分析鉴定微生物遗传型 1 DNA碱基比例的测定：
10、即“G+C”百分含量，表示DNA分子中鸟嘌呤和胞嘧啶所占的摩尔百分比值。（G+C）mol%=*100%,每个生物种都有特定的GC%范围，因此 可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25-75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。,通过多种生物的GC比后，可以发现：亲缘关系相近的种，其基因组中核酸序列相近，故两者的GC比也越接近；GC比差距大的两种微生物亲缘关系远；GC比是建立新分类单元时的可靠指标。测定DNA中的GC比的方法很多，其中解链温度（Tm）法常用，其具有简单易操作、重复性好的优点。,同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在45%以下；同属不同种的差别应低于1015%；G+C
11、含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义。,若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差别大于5%，则肯定不是同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。,2.核酸的分子杂交按碱基的互补配对原理，用人工方法对两条不同的单链核酸进行复性，以构建新的杂交双链核酸的技术，称为核酸杂交。此法可用于DNA-DNA、DNA-rRNA、rRNA-rRNA分子间的杂交。分子杂交是测定核酸分子同源程度和不同物种间亲缘关系的有效手段,不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映生物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近，反之
12、亦然。,直接分析比较DNA的碱基排列顺序,-由于技术上的困难目前尚难以普遍地进行；,核酸分子杂交(hybridization)间接比较不同微生物DNA,碱基排列顺序的相似性,1）DNA-DNA杂交；,（亲缘关系相对近的微生物之间的亲缘关系比较）,2）DNA-rRNA杂交；,3）核酸探针；,（利用特异性的探针，用于细菌等的快速鉴定）,（亲缘关系相对远的微生物之间的亲缘关系比较）,4）电子杂交,随着微生物基因信息，特别是全基因组完全测序的不断增加，我们可以通过各种计算机软件对不同物种的遗传信息进行直接比较，从而分析不同微生物间的亲缘关系。,3 rRNA寡核苷酸编目（oligonucleotide
13、catalog）分析 一种通过分析原核或是真核细胞中最稳定的rRNA寡核苷酸序列同源性程度，以确定不同生物间的亲缘关系和进化谱系的方法。,选用16srRNA或18srRNA作生物进化和系统分类研究有以下优点：rRNA普遍存在于真核和原核微生物的细胞中，应用广；它们的生理功能既重要又恒定；在细胞中的含量高、较易提取；编码rRNA的基因十分稳定；,基本原理：利用一种RNA酶水解rRNA后，可产生一系列寡核苷酸片段，如果两种或两株微生物的亲缘关系接近，则其所产生的寡核苷酸片段的序列就越接近。,16S、18S RNA,rRNA寡核苷酸编目分析的方法：用32P标记的被测菌株rRNA提纯；用专一水解G上3
14、端磷酸脂键的T1RNA酶进行水解，产生一系列以G为末端的长度不一的寡核苷酸片段；双向电泳分离，再用放射自显影技术获得rRNA寡核苷酸群的指纹图谱；分析图谱中链长在6个核苷酸以上的寡核苷酸作序列；按不同长度进行编目、列表；通过比较、计算和分析，就可定量地知道被测菌株间地亲缘关系。,4 微生物全基因组序列的测定通过测定微生物的全基因组，绘制图谱，分析比较微生物间的关系。,二）细胞化学成分用作鉴定指标,1 细胞壁的化学成分：原核微生物细胞壁成分的分析，对菌种鉴定有一定的作用。肽聚糖短肽尾的第三位氨基酸的不同：赖氨酸；内消旋二氨基庚二酸；L-DAP；,2 全细胞水解液的糖型：放线菌全细胞水解液可分为4
15、类主要糖型，阿拉伯糖、半乳糖，如诺卡氏菌；马杜拉糖，如马杜拉放线菌属；无糖，如高温放线菌属；木糖、阿拉伯糖，小单胞菌属。,3 磷酸类脂成分的分析：位于细菌、放线菌细胞膜上的磷酸类脂成分，在不同属中有所不同，可用于鉴别属的指标。,4 枝菌酸：不同微生物细胞的枝菌酸有所差别，碳原子数目有差异，可用于鉴别微生物。5 醌类的分析：原核微生物有的含甲基萘醌（VK），有的含泛醌，它们在放线菌鉴定上有一定的价值。6 气相色谱技术用于微生物鉴定：分析微生物细胞和代谢产物中的脂肪酸和醇类等成分，对于厌氧微生物的鉴定具有实际意义。,（三）数值分类法：是一种依据数值分析的原理，借助计算机技术对拟分类的微生物对象按大
16、量表型性状的相似程度进行统计、归类的方法。,2.操作分类单位(operation taxonomic unit)缩写为OTU,指分类研究的个体，细菌分类中一般是指菌株。,表观群(phenon):表观群指建立在表面特征相似的基础上的类群，一般是数值分类得到的类群。,计算两菌株间的相关系数,Ssm=,Sj=,上式中，a为两菌株均呈正反应的性状数，b为菌株甲呈正反应而乙呈负反应的性状数，c为菌株甲呈负反应而乙呈正反应的性状数，d为两菌株均呈负反应的性状数,列出相似度矩阵将矩阵图转换成树状谱,end,数值分类工作的程序,1.选择菌株和待测性状 2.性状编码3.相似性计算 4.进行簇群分析5.分类结果的
17、表示,选择菌株和待测性状,拟测定的性状：包括形态、生理生化和生态等指标。,待测菌株：包括相关已知种的模式菌株。菌株数目从几十到几百个，注意代表性。,性状编码,多态特征:则按相关规定将其分解为多个两态特征，或转换为二态特征。,两态特征:阳性结果记录为+，阴性为-，输入计算机时阳性是1，阴性用0，资料缺失用N表示。,将测得的性状状态记录转变成计算机能够识别运算的符号。,相似性计算,Ssm(匹配系数)Ssm=(a+b)/(a+b+c+d)Sj=a/(a+b+c+d)a：表示两个OTU性状编码皆为“1”的个数；b：表示一个OTU为“1”，另一个OTU为“0”的性状个数；c：表示一个OTU为“0”，另一个OTU为“1”的性状个数；d：表示两个OTU皆为0的性状个数。,根据性状测定结果计算出相似的系数，它是各个OTUs之间相似程度的量值。,进行簇群分析,簇群分析也叫聚类分析(cluster analysis),在考察各个OTU之间的相似性后，按相似的大小进行分群分类，以揭示各个OTU之间的相关性。,聚类分析分类结果的表示,矩阵图 是以不同阴影的方块代表不同的相似百分数。树状图 中最高的分枝表示相似值较高的簇群，往下则为相似值较低的簇群，分类结构一目了然。通过对现有已知种的描述和大量数据的调查，确定相似值80%以上的相当于种。,
