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1、激光共聚焦显微镜应用技术 蛋白的细胞器定位,分子生物学课件,Confocal Laser Scanning Microscopy,Zeiss LSM 510 META,激光共聚焦显微镜的基本结构,激光光源 冷却系统 扫描器 光学装置 荧光显微镜系统 图象存储与处理及控制系统,针孔光栏 分光镜 发射荧光单色器 检测器,激光扫描共聚焦显微镜（LSM）是当今世界上最先进的分子生物学分析仪器之一。它是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外光或激光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，观察细胞的形态变化或生理功能的改变。成为形态学、分子细胞生物学、
2、神经科学、药理学和遗传学等领域中新的有力研究工具。,激光共聚焦显微镜在生物学中的应用,原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构检测核酸检测蛋白质细胞定位检测细胞凋亡细胞器的观察及测定检测细胞融合观察细胞骨架检测细胞间缝隙连接通讯检测细胞内脂肪,活体细胞或组织功能的实时动态监测实时定量测定细胞内Ca2+变化测定细胞内pH变化检测膜电位变化检测细胞内活性氧物种的产生检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位检测荧光共振能量转移检测荧光漂白恢复,荧光显微镜系统,激光共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点。需与扫描器连接。使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样
3、品发射的荧光到达检测器。需有光路转换装置。即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。荧光镜座要有防震动装置。,激光共聚焦显微镜工作原理示意图,激光经放大、分光后由物镜聚焦于焦平面上，同时，焦平面上被激光扫描的点F所发出的一定波长的荧光通过检测针孔光栏达到检测器，并成像于显示器上，得到相应的荧光图象。,激光共聚焦显微镜基本操作,获取共焦图像的步骤在 VIS 模式中观察样品装入 LSM 配置扫描图像保存图像,不同厚度光切图像,Z轴扫描 时间系列扫描 Z轴扫描时间系列扫描,Z轴扫描、时间系列扫描,组织和细胞样品中荧光的来源,自发荧光荧光染色免疫荧光荧光抗体法产生荧光外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光
4、酶致荧光,荧光样品的制备要求,荧光标记反应的特异性强、荧光定位准确保持样品应有的结构形态完整性荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性荧光强度适宜荧光稳定性好样品的荧光分布均匀两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉可以消除图象背景干净、干扰杂质少,荧光探针的种类及应用,原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白（GFP、YFP等）活体细胞或组织功能的实时动态监测实时定量测定细胞内Ca2+变化：fluo-3/AM，fura-2,荧光探针标记样品的过程,样品预处理给药、切片或细胞标本的制备荧光探针标记样品,百合花粉管钙离子浓度梯度检测,液体培养基中
5、培养百合花粉观察花粉管生长情况，长度大概为花粉粒直径的25倍，过长的花粉管会弯曲扭转不利于观察。,荧光探针,Fluo-3（/AM）属于单波长染料，用于测定钙离子的相对浓度。Fluo-3/AM是fluo-3的一种乙酸甲酯衍生物，fluo 3/AM是脂溶性物质，能跨膜进入细胞。在细胞浆中被水解脱掉AM后，变成游离的fluo-3，因其不具备跨过完整细胞膜的特性因此停留在细胞内。游离配体形式的fluo-3是非荧光性的，但是当它与Ca2结合后，形成具有荧光的fluo-3-Ca，是细胞荧光强度增加40至80倍，而且其荧光强度与细胞内Ca2呈正相关，因此可以得到Ca2浓度。另外Fluo 3对于紫外光照射下可
6、裂解的螯合钙或其它形式的钙也有作用。,save“projection”,Projection,图710.7.连续降温下生成Ca2+荧光随时间变化的曲线同时记录的荧光图像,显示冬小麦胞内荧光有相同的变化趋势。8.连续降温下生成Ca2+荧光随时间变化的曲线同时记录的荧光图像,显示春小麦胞内荧光有相同的变化趋势。9.Fluo-3/AM染色后,静息态下冬小麦原生质体的三维重组图像。10.Fluo-3/AM染色后,静息态下春小麦原生质体的三维重组图像。,刘炜等，低温处理对冬、春小麦细胞Ca2+时空变化的影响，植物学报，2001，43(12):1218 1223,目的蛋白细胞器定位观察,含有荧光蛋白的载体
7、pA7-GFP目的基因洋葱表皮,XbaI,SmaI,BamHI,目的蛋白细胞器定位观察,含有荧光蛋白的载体pA7-GFP,CaMV 35S Promoter,XhoI,NcoI,SalI,SpeI,GFP,目的基因,目的蛋白细胞器定位观察,对提取的质粒，用目的基因的引物进行PCR鉴定，出现了目的片段。根据pA7-GFP Vector上提供的酶切位点，对重组质粒进行双酶切，酶切后进行电泳分析，也出现了目的片段，表明目的片段已经和质粒DNA重组。,图3-9 pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定酶切：重组质粒酶切产物；M：Marker DL 2000；PCR：重组质粒PCR产物,目的蛋白细胞
8、器定位观察,含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约20 L分别加入1.5 mL离心管中，分别加入500 L的蒸馏水，两管分别标号P1，P2。(2)分别取4片约1.5 cm*1.5 cm大小的洋葱表皮放入P1，P2。(3)将P1，P2管管盖打开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。(4)将P1，P2管进行抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。(5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。(6)取出P1，P2管中的洋葱表皮，将其铺在MS培养基的滤纸上，加少量的水培养16小时。,目的蛋白细胞器定位观察,Bright GFP Merged,TTG1在津田芜菁洋葱表皮细胞中的瞬时表达检测A-C：GFP蛋白在洋葱表皮细胞中的表达；D-F：TTG1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的表达；A、D：透射光下的表皮细胞；B、E：发射光下的洋葱表皮细胞；C、F：发射和透射复合光下的洋葱表皮细胞,35S:GFP,a,b,c,35S:BrTTG1-GFP,d,e,f,
