《酶的分离纯化概述.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶的分离纯化概述.ppt（39页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、1.6酶的分离纯化,孙利芹 2013春,提 纲,蛋白质纯化的一般考虑 蛋白质的粗分离蛋白质的大规模分离纯化,一、蛋白质纯化的一般考虑,为测序或克隆的目的，只需几微克；为工业或医药的用途，则可达几千克,从量上考虑,从纯化的标准,为临床治疗所需，纯度应达到98%或99%以上；用于其它一般用途，要求低,遵循的原则,分离纯化的原料来源方便，成本低；目的蛋白的含量、活性相对高，可溶性和稳定性好；破碎细胞的环境要尽可能温和，尽早除去杂质、脂类、核酸及毒素等；操作缓冲液中的物质成分要审慎考虑，避免随意性；建立灵敏特异的监测方法十分重要，是判断目的产物产率、活性和纯度的前提；纯化策略的选择要适当,工艺次序的选
2、择策略,选择不同机制的分离单元组成一套工艺；将含量多的杂质先除去；将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段,以酶的提出为例,材料的选择和细胞抽提液的制备 蛋白质的浓缩和脱盐 沉淀法分级蛋白,二、蛋白质的粗分离,（一）材料的选择和细胞抽提液的制备,材料的选择 从动物组织或体液中分离蛋白时，取到材料后要迅速 充分脱血后冻结保存；从植物材料中分离蛋白，注意：有效的破碎方法；防氧 化；选用高浓度缓冲溶液 从微生物中提取蛋白，原料来源不受限制的特点细胞破碎方法 细菌的细胞壁骨架-肽聚糖，由聚糖链交联而成（N-乙 酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸）酵母细胞壁：葡萄糖与甘露聚糖及蛋白质等 大多数真菌的细胞壁有多糖组
3、成（几丁质和葡聚糖）,细胞破碎方法,许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。主要方法有：,JY92-II D超声波细胞粉碎机,高压细胞破碎机,细胞破碎珠,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,1、机械破碎：2、物理破碎:3、化学破碎4、酶解破碎,有机溶剂,表面活性剂处理,冻融法,溶菌酶,破碎方法的选择,选择原则：细胞数量；所需产物对破碎条件的敏感 性；要达到的破碎程度；破碎所必要的 速度；缓冲液的选择。常用的缓冲液：20-50mmol/L的磷酸缓冲液；0.1mol/L Tris-HCl，必要时可加入 EDTA、巯基乙醇或蛋白稳定剂等胞外酶：过滤、离心等方法出去菌体,细胞抽
4、提液的制备,酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理细胞破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过程。,1、盐溶液提取法2、酸溶液提取法3、碱溶液提取法4、有机溶剂提取法,提取举例,固体发酵麸曲中，淀粉酶、蛋白酶等胞外酶用0.14mol/L的NaCl或的磷酸缓冲液提取；枯草杆菌碱性磷酸酶用0.1mol/L的MgCl2溶液提取；核酸类酶（R-酶）用0.14mol/L的NaCl提取,胰蛋白酶用0.12 mol/L的硫酸溶液；细菌L-天冬酰胺酶用pH11-12的碱液提取；琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶可用与水混溶的丁醇提取；R-酶的提取常用苯酚水溶液提取；,（二）蛋白质的浓缩和脱盐,经盐析法法沉淀的蛋
5、白在进一步提纯以前常要除盐，常用的方法有：透析法：处理量小，操作时间长（5h以上），操作容易 纤维过滤透析法：特点：处理量大，时间短，操作稍难，膜昂贵 分子筛层析法：常用Sephadex-G-25或Bio-gel(聚丙烯酰胺凝胶)蛋白质浓缩的方法：沉淀法、吸附法、干胶吸附法、渗透浓 缩法、超滤浓缩法等,操作方便、迅速、处理量大,多孔板,（三）沉淀法分级蛋白,盐析法 有机溶剂沉淀法 有机聚合沉淀法 选择性变性沉淀法,盐析法,盐析方程:,Ks分段盐析:lgS0=Ks:盐析效率，是蛋白质和盐种类的特征常数。在一定pH和温度条件下，利用不同蛋白质的Ks不同,向蛋白质水溶液中加入中性盐，可以产生两种影响
6、:盐溶现象和盐析现象,分段盐析：S0随pH和温度的变化而变化,在一定的I值下通过改变pH 和温度来分离蛋白.,盐析法的优点:操作简便,使用范围广;中性盐对易变性的蛋白质有一定的保护作用;能同时除去较多的蛋白质,有纯化作用;有浓缩蛋白溶液的作用缺点:分辨能力差,纯化倍数低。,有机溶剂沉淀法,选择原则：必须与水混溶不与pr反应较好的沉淀效应溶剂蒸汽无毒，且不易燃 乙醇和丙酮是广泛使用的两种溶剂,通过降低溶液的介电常数，增强偶极离子间的静电吸引，从而使分子聚集沉淀。此外，有机溶剂本身如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质
7、往往引起变性,F=Q1Q2/r2,有机聚合沉淀法,水溶性中性高聚物也能沉淀蛋白。相对分子量高于4000(通常用6000和20000)的PEG(聚乙二醇)能有效的沉淀蛋白。PEG难于从蛋白分级物中除去，但由于它对蛋白无害，不影响盐析、离子交换、亲和层析等操作的进行，特别是用于工业规模的应用。聚丙烯酸可沉淀带正电荷的蛋白,热变性 pH变性有机溶剂变性 氯仿变性血红蛋白是常用的有机溶剂变性的实例，将细胞匀浆液与乙醇-氯仿一起振荡，则可使血红蛋白沉淀变性,选择性变性沉淀法,大规模？蛋白质的来源及释放分离和浓缩大规模层析技术,三、蛋白质的大规模分离纯化,蛋白质的来源及释放,微生物来源的蛋白优势：含有动物
8、蛋白没有的 利用遗传变异筛选高活力的酶制品 任意规模生产，保证连续供应 高水平表达所需蛋白 大规模释放细菌蛋白质最常用的是剪切法，主要设备:Manto-Gaulin匀浆机和Dyno-Miu球磨机，其中前者更为普及。,分离和浓缩,固液分离的方法:离心:工业用连续流动离心机。常用的有：转筒形离心机和间歇卸料的圆盘式离心机。过滤:微生物抽提液常与凝胶化的趋向，难于用传统的方法有效地过滤，容易发生堵塞，通常加入助滤剂或直接加入凝固剂等方法改善过滤性能。工业常用的分离设备：板框过滤机、鼓式真空过滤机。一种新的技术：涡流膜过滤法（cross-flow membrane filtration）,也叫错流过滤
9、。已成功地应用于羧肽酶、芳基酰胺酶的分离,双水相体系萃取法:适用于直接从含有菌体等杂质的酶液中提取纯化目的酶，它不仅可以克服离心和过滤中的限制因素，而且使酶与多糖、核酸等可溶性杂质分离，具有一定的纯化效果。双水相的形成：将两种不同水溶性聚合物的水溶液混合 时，当聚合物浓度达到一定值时，体系自然分成互不相 容的两相，形成双水相。产生分离的推动力：聚合物水溶液的疏水性差异 常用的双水相体系：PEG/葡聚糖(dextran)；PEG/磷酸盐 萃取原理：利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。影响分配的因素:双水相体系的性质;要分离物质的 性质;离子性质;环境因素,优点：a.处理量大，750L双水相处
10、理1000Kg细菌细胞糊 b.所需设备简单；c.操作方便、快速、条件温和，收率可达80%-90%d.不要求特殊处理就和于后续提纯步骤相衔接发展:到目前为止,用此法研究过的酶达50多种.近10年,Kula等开发了某些酶的双水相体系分离流程,成功 地从微生物碎片中提取纯化甲酸脱氢酶等一系列的 酶,处理量达50 Kg湿细胞,150Kg酶蛋白,收的率在 90%以上.是生物化工中极有开发前途的蛋白质或酶的分离纯化技术 将疏水基团、离子交换基团、活性染料等引入聚合物上加强蛋白质或酶在某一相中的分配，是抽提更有效，各具特异性.如将汽巴克隆蓝固定在PEG上，只经两步抽提，就将酵母磷酸果糖激酶提纯58倍。,浓缩
11、技术:,沉淀法：非离子聚合物包括PEG 可以工厂规模选择性 沉淀蛋白。特点：无毒、不易燃，而且对蛋白有保护作用 聚丙烯酰胺，成功地在工业化规模从曲霉 Aspergillus.spp中纯化淀粉葡萄糖苷酶，从大 豆中生产淀粉酶。其优点是在浓度较低时就能起 到沉淀作用超滤法：是浓缩蛋白溶液的标准实验室方法，对于大 规模浓缩有两种方法：湍流式超滤器：膜面积可达0.07m2，超滤速度可达10 L/h 中空纤维膜超滤器:工业规模使用的膜面积可达6.4m2，超滤速度可达200 L/h,大规模层析技术,1.离子交换层析2.凝胶层析3.疏水层析4.亲和层析5.HPLC,1.离子交换层析,大规模纯化中最有用的一步
12、，分辨率高，纯化规模易扩大，可分批操作,常用的层析柱有:CM-纤维素、DEAE-Sephadex 例如，从胡萝卜软腐欧文菌中纯化天冬酰胺，若用CM-纤维素分批吸附、洗脱，可是样品纯化6倍，体积减少 99%。缺点：床体积容易被压缩，随pH的变化，床体积也变。新的交换柱：将离子交换基引入到交联琼脂糖（如Sepharose Fast Flow）或大孔合成凝胶上。优点：离子交换材料既坚硬，吸附容量又大；其颗粒 为小球形，既能保持高流速又具有高的分辨力，适用 于大规模层析。,2.凝胶层析,适用于纯化的后期阶段，传统的凝胶介质中Sephadex Bio-gel由于机械强度差，不适于大规模操作，介质颗粒坚硬
13、、耐压对大规模操作来说特别重要，因为他决定是否获得高流速,SephacrylTrisacryl SuperoseUltrogel,实例：用40 L sephacryl S-200柱纯化了限制性核酸内切酶。,接有辛基和苯基的琼脂糖是最常用的疏水吸附剂。特点：吸附容量大，适用于纯化的任何阶段，尤其适合于离子交换和盐沉淀之后；还有清除DNA和 热原的作用，适用于生产人用药物。原理：蛋白质分子表面有部分疏水性区域，若在一极性很强的环境中，则会被吸附在非极性的固定化相载体上；若环境的极性降低，则可被溶离出来，即为疏水性层析法（HIC）,其作用力为非极性基团间的疏水性引力。与离子交换层析相比，虽然选择性较
14、低，但不同类型的疏水吸附剂之间存在选择性。,3.疏水层析,应用：用超氧化物歧化酶为模型蛋白，将疏水层析扩大到工厂规模，100L发酵罐生产的材料可用15L的疏水柱一次纯化，经用SDS-PAGE鉴定产品纯度，所有数据与实验室规模相同。,3.亲和层析,利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的技术。,规模化应用的例子：甘油激酶、甘油脱氢酶、羧肽酶。,4.高效液相层析（HPLC）,已开发出以克量级纯化蛋白质的HPLC技术。唯一的例子是用三嗪染料亲和纯化乳酸脱氢酶，每次层析可处理1.8g蛋白质，得到97mg均一的酶，收的率46%，耗时1h。由于HPLC的柱体积可以加大，仪器操作自动化，可以在同一柱上反复负载样品，所以大规模制备的潜力很大。Waters公司已有用于大规模制备的层析柱。,The end!,第一章复习题,1、什么是酶工程，其研究的内容有哪些?2、什么是酶的活性中心？其组成的氨基酸残基按功能性分哪几类？3、目前公认的酶的作用机制有哪些？研究酶动力学和酶的抑制作用对于了解酶的作用机制有何帮助？4、什么是别构酶和别构效应？它是怎样调节酶活力的？5、简述生物体内酶活性的调节方式有哪些？6、常用的酶蛋白的脱盐方法有哪些？沉淀法分级蛋白的方法通常有哪些，其各自的特点是什么？7、适用于工业化规模固液分离的方法有哪些？酶的大规模层析技术有哪些，简述其基本原理？,
