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1、第六讲免疫荧光组化技术,主要内容一、荧光的特征二、荧光素三、荧光素标记抗体的方法四、荧光抗体的质量鉴定五、免疫荧光组化染色方法六、荧光显微镜七、非特异性荧光的消除方法 八、激光扫描共聚焦显微镜,思考题： 1.什么叫荧光？ 2.常用荧光素有哪些特征？ 3.标记荧光抗体有哪二种主要的制备方法？,4.免疫荧光组化直接法、间接法的 原理和主要操作流程？ 5.观察荧光组化片时应注意哪些问题？ 6.非特异性荧光的消除方法有哪几种？,一、荧光的特征 分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则，要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级
2、差相对应的特定能量的吸收或释放。,激发 当电子吸收能量跃迁到较高能级， 这个过程叫激发。发射 以辐身方式跃迁时，能量转化成相 应波长的光，这个过程叫发射。,荧光 跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐身方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。,二、荧光素 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。,1、具备用于标记抗体的荧光素条件(1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未结合的色素及其降解产物易排除。,(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光 素质量
3、下降不多。(3)标记后对抗体的免疫学性质和生化 性质无影响。(4)结合方法简便而快速，并且较稳定。,(5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其 他物质发生化学反应。(6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜 色对比鲜明，能清晰判断结果。,2.荧光素的种类(1)异硫氰酸荧光黄（FITC）：分子量390D，最大吸收光谱为490495nm，最大发射光谱为520530nm。呈现明亮的黄绿色荧光，分子量389.4。,(2)四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）是罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱为620nm，呈橙红色荧光。,(3)四乙基罗达明(RB200) 呈褐红色粉末状，溶于乙醇和丙酮，
4、性质稳定，可长期保存。最大吸收光谱570nm，最大发射光谱596600nm，呈明亮橙红色荧光，分子量580，RB200不能直接和蛋白质结合，要先经五氯化磷反应，转化成硫酰氯，再与蛋白质的氨基结合。,(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯(5)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）(6)得克萨斯红（Texas red）(7)藻红蛋白（PE）(8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）,三、荧光素标记抗体的方法(一)FITC标记抗体的方法 1.Marsshall法(1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸 -氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有
5、86个赖氨酸残基，一般最多能结合1520个。,荧光素FITC-NC N-蛋白质 S H H FITC- N C N - 蛋白质 H S H,(2)操作流程 抗体与荧光素比例为50-100:1抗体的准备：20mg/ml，碳酸盐缓冲液为总 量的1/10。荧光素的准备：用分析天平准确称取 0.01mgFITC/1mg抗体。结合：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体 溶液中。,透析 过柱 SephadeG50或 G25 保存 4 -40等量甘油分装保存。2.Chadwick法3.改良法4.透析标记法（二）四乙基罗达明标记抗体方法（三）藻红蛋白标记抗体方法,四、荧光抗体的质量控制主要进行特异性和敏感性两个方面
6、的鉴定。1.特异性染色效价测定2.非特异性染色测定3.吸收试验4.F/P比值的测定方法,五、免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法 简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。,(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37温育1h，PBS洗33min。(3)0.01%伊文氏蓝衬染13min，PBS洗33min，蒸馏水洗2次，除去Nacl结晶。(4)pH9.0缓冲甘油封片。(5)镜检,2.间接法 是直接的重要改进，先用标记的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结合，随后用间接荧光标记二抗与一抗
7、特异性结合。,操作流程 (1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS洗33min。(2)适当稀释特异性一抗，37孵育1h，或室温4h，或4过夜，PBS洗33min。,(3)荧光标记二抗适当稀释37 30min，PBS洗33min。(4)0.01%伊文氏蓝衬染13min，PBS洗33min。(5)封片，镜检。,六、荧光显微镜检查方法 1.荧光显微镜 荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具。它是由超高压光源，滤片系统(包括激发和压制滤板)，光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。,(1)光源 光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率
8、汞灯可满足激励一般荧光染料的要求。对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，引起球内水银蒸发，经过515min，球内气压升至5070标准大气压，此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。,(2)滤片系统 是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件。,滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其他一些中性滤片。,荧光显微镜的滤片系统,2.标本制作要求(1)载玻片厚度应在0.61.2mm之间(2)盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右(3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消
9、耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激分。,(4)封片剂 常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.59.5时较亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.09.5的碳酸盐缓冲液等量混合作封片剂。,荧光信号增强封片剂 mowiol 40-88 4.8g 甘油 12ml 蒸馏水 12ml 0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml,上述混合（加热溶解），5000g离心，15min，最后加入1.4-diazobicydo-2,2,2-octane(DABcos)，终浓度2.5%(约1.25g)，溶解后，分装存于-20中。(5)镜油,3.使用荧光显微镜注意事项(1
10、)严格按说明书操作，不要随意改变程序。(2)应在暗室中进行检查。(3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。(4)检查时间每次以12h为宜，超过90min，超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。,(5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。光源关闭后必须在30min后才能再启动光源，一天中应避免数次点燃光源。,(6)标本染色后应立即观察。(7)荧光高度的判断标准，分四级“ ”为阴性，“ ”为仅能见明确可见的荧光；“ ”为可见有明亮的荧光；“ ”为可见耀眼的荧光。,七、非特异性染色的消除方法根据产生的原因采取适当的方法，常用方法： 1.动物脏器粉末吸收法 2.透
11、析法 3.Sephadex G-50柱层析法 4.DEAE纤维素柱层析法 5.荧光抗体稀释法 6.纯化抗原方法 7.纯化抗体方法 8.伊文氏蓝衬染方法：0.01%伊文氏蓝,八、激光扫描共聚焦显微镜 激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)是80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品。,实现了对细胞内部非侵入式光学断层扫描成像，从而对被检物体样品从停留到表面单层，静态平面的观察进行到立体，断层扫描、动态全面的观察，在生命科学研究中得到迅速应用。,1.仪器构成 (1)计算机系统：控制着机械，光学、声学系统及各种外围设备。 (2)
12、激光照射系统：氩离子激光器和声光调节器。,(3)显微镜系统，它主要由倒置显微镜和共聚焦系统组成。(4)检测系统，由检测器，检测放大器等元件组成。(5)XY平台 (6)Z-轴步进马达,2.共聚焦成像原理 激光器发出的激光束经过光的扩束和整形，变成一束直径较大的平行光束，长通分色光镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发出沿各个方向的荧光，,一部分荧光经过物镜，长通分色反射镜，聚焦透镜，会聚在聚焦透镜的焦点外，经过焦点处的针孔，由检测器接收并转变成电信号。,3.光信号接收和成像方式(1)光信号接收 生物样品发出的荧光通常有二种接收方式：由光电倍增管（PMT）
13、把光信号转变成电信号；利用电荷耦合器（CCD）把光信号转变成电信号。,(2)成像方式 载物台运动成像：以直径很小的激光束照射样品，照射点发出的荧光信号经PMT变成电信号，然后载物台移动到下一点，记录该点的荧光强度。该方法无轴向像差，成像时间长；,反射扫描成像方式，通过转动反射镜使激光连续照射样品，由CCD摄像机记录下照射点所发射的荧光，成像速度快。,4.参数的选择 基本参数：Confocal,pinhole,detector, PMT,Stepsize, X points, Y Points, scanstr,speed,LaserPwr,Auto zoom, Display, BR subv
14、al,Samples/pt等,5.性能特点：分辨率高，灵敏度高，扫描速度快，扫描范围大，图像存取方便，可进行光切片的观察，可进行定量荧光分析。,6.应用 (1)组织光学切片 可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列“ 光学切片”，得到其各层面的信息-“ 显微CT”。 (2)三维图像重建,(3)细胞物理和生物化学测定(4)荧光的定量、定位分析(5)Ca2+、pH及其他细胞内离子的实时定 量测定(6)粘附细胞的分选,(7)激光细胞显微外科及光陷阱技术(8)荧光光漂白恢复（FRAP）技术(9)胞间通讯的研究(10)细胞膜流动性测定(11)光活化技术,实习1 免疫荧光组化-间接法1.4 m石蜡切，5
15、8烤，18h。2.常规脱蜡至水（二甲苯、各10min，无水乙醇，95乙醇，85乙醇，75乙醇各2min）。3.PBS洗（磷酸盐缓冲液0.01mol/L pH7.4）33min。,4.0.1%胰蛋白酶（100ml蒸馏水中加入100mg胰蛋白酶，100mg氯化钙，用0.1N NaoH调pH至7.6），37，消化30min。5.0.01mol/L pH7.4 PBS洗33min。6.兔抗人AFP1:50（用专用抗体稀释液稀释）37，1h或室温4h，或4过夜。,7.PBS洗33min。8.羊抗兔IgG-F，1:20稀释，37，1h，室温2h。9. PBS洗33min。10.蒸馏水洗3min。11.pH9.0缓冲甘油封片。12.镜检，阳性呈明亮绿色荧光。,
