有机质谱原理及应用ppt课件.ppt

《有机质谱原理及应用ppt课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《有机质谱原理及应用ppt课件.ppt（99页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、1,有机质谱原理及应用,第五章：质谱法测定分子结构(II), 大分子,2,方法：ESI和MALDI两种电离方法。 对象：带有官能团的可溶解高分子。1988年，Tanaka，最早报道聚乙烯醇(PEG)， 22,000。1992年， Danis， MALDI， 聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸，30,000。 M. Karas & F.Hillenkamp MALDI，聚苯乙烯 70ku， PEG 40ku。1996年，C. Fenselau，聚苯乙烯 1500ku。,5.1 高聚物质谱分析,3,一、质谱方法分析高聚物的特点 1、人工合成高聚物的复杂性 合成高分子是混合物，分子量是一种分布。 不同的引发和终

2、止反应所得的高分子有不同的端基。 在随机共聚物中，高分子链的组成呈现某种化学分布。 在嵌段共聚物中存在着不同的嵌段长度和顺序。 非线性高分子，如环状、支链和树枝状高聚物。 2、质谱分析高聚物的特色样品用量少、耗时短、速度快。仪器分辨率高使单体分析和端基分析成为可能。直接测定绝对分子量，而不是相对分子量，精度高于光散射和膜渗透方法。测定分子量时，不需要标准品或Mark-Houwink常数。由分子量分布可获得聚合反应的链增长常数。,4,二、MALDI-TOF方法测定高聚物影响因素 1、基质 基质的作用：从激光脉冲中吸收能量。要求：基质对激光光源必须有很强的吸收。使被测分子分离成单分子状态。要求：基

3、质和被测高分子具有很好的相容性，同时不能有强的分于间的相互作用。 使用不同种类的激光(IR，UV)电离，需要用不同类型的基质。 紫外激光解离的基质 蒽三酚和银盐的混合是分析聚苯乙烯的首选，但是这个混合物不稳定，见表格。 红外激光解离的基质 YAG激光(3.27m，相当于 3050 cm-1) 激发C-H的伸缩振动。应用于UV-MALDI的基质也可用于IR-MALDI。,5,红外激光与紫外激光电离的比较： 红外激光有较强的穿透能力，一次红外激光照射能够解吸更多的样品，因此在一个样品点上获得的质谱图较少，要经常更换激光照射点。 红外激光的脉冲较长。一般在 1020 s，而通常的紫外激光的脉冲约在

4、35 s，这导致了IR-MALDI的分辨率较差。一般来讲，紫外激光器更适于分析合成高分子，红外激光器可用于一些卤代高分予的分析。,基质的选取：极性相似原则！,常见基质的极性比较,6,UV-MALDI基质的理化性质,7,2、盐效应 高分子测定过程中的阳离子化不是质子转移反应，而是金属离子与高分子发生阳离子化反应，形成加合的高分子正离子。一般用Na+、K+等作为加合离子。有时不需要特别加入这些金属，亦可以得到加合的正离子，这是由于容器上的Na+或K+所致。具有杂原子的合成高分子，在加钠盐、钾盐后产生加合金属阳离子的正离子。聚醚、聚酯、聚丙烯酸酯、聚酷胺等。没有杂原子的非极性合成高分子，如聚苯乙烯、

5、聚丁二烯、聚异戊二烯在加入银盐或铜盐后能够成功的离子化，这些金属阳离于与高分子中的双键发生了作用。 没有杂原子和双键的合成高分子如聚乙烯和聚丙烯目前仍较难被MAIDI分析，因为它们的金属阳离子结合能极低。,8,3、样品制备简单混合法： 在使用一个特定的样品制备方法时，必须先选择适用于基质、样品和阳离子化盐的溶剂，最理想的情况是使用一种溶剂这样可以减少样品在靶上结晶时分层的危险。然而，盐类几乎不溶于用于非极性合成高分子的有机溶剂。一般来讲，盐可以先溶于一个中间溶剂如丙醇中，然后再用用于基质和样品的溶剂稀释。制备样品时，应选择适当的溶剂、合适的浓度及配比，才能获得较好的结果。电喷雾法 一个很有前途

6、的样品制备方法是电喷雾沉积法，比起传统的干点甚或薄层法，电喷雾法的优点在于它可以形成小而均匀的结晶体。电喷雾沉积法制得样品的点点之间重复性好，并且信号强度较大，层式的电喷雾效果更好一些。 压片法 对于不溶的高分子样品，如聚氨酯和大的多环芳香化台物，发展了一砷新的制样方法压片法即将样品和基质按一定比例混合后用球磨机研磨均匀，压成薄片进行MALDI-TOF-MS分析。,9,三、MALDI-TOF方法测定高聚物的应用1、分子量的测定及分子量的分布 计算公式：,当分子量的分散度小于1.2时可获得符合Poisson分布的质谱图，与GPC的结果一致。,Mn： 数均分子量Mw： 重均分子量PD： 分布常数n

7、i： 第i个寡聚物的相对丰度Mi： 第i个寡聚物的质量,PS 2800的MALDI-TOF质谱图,PEG 2000的MALDI-TOF质谱图,10,PEG 3100的MALDI-TOF质谱图,PS 29ku 的MALDI-TOF质谱图,MALDI-TOF-MS方法与GPC方法所测分予量的比较,11,2、末端基分析,含有联吡啶 的共轭高分子结构,聚合物的MALDI-TOF质谱(a) IAA为基质, (b) IAA为基质。并加入细AgTFA,12,高分子化合物3(n=5)，环状寡聚物的实验结果(左)和理论同位素分布(右)(a): (C28H32N2S)5+H+ (b): (C28H32N2S)5+

8、Ag+,选取2142.1u的单同位素峰来计算端基的质量。重复单元的质量是428.2, 代入2142.1/428.25，即428.2 52141。这个峰的质荷比等于5个重复单元加1个质子比时带上的氢原子的质量，因此可以椎测这个系列的高分子为环状高分子没有端基。,13,35u + 158u + H + 237u 6 = 1616u35u + 140u + H + 237u 6 = 1598u17u + 140u + H + 237u 6 = 1580un=6,一种寡聚物的MALDI-TOF质谱分析 两种单体：,三嗪聚胺的MALDI-TOF的质谱,14,3、高分子混合物分析 用MALDI分析不同种类

9、的高分子混合物的文章很少也许是因为离子化效率的显著不同和其他一些歧视固素。例如二两种窄分布的标准品PS10200和和PMMA9200分别溶解在THF中，以几种体积比混合，接着以IAA为基质加甲酸钠或以蒽三酚为基质加三氟乙酸银。在第一套实验方案中，PS和PMMA的体积比从0:1增加到199:1，基质是IAA/Na，也就是对PMMA是最佳条件，试验结果十分令入惊奇，甚至PMMA是以0 5的不纯物存在干PS中，质谱图仍然是PMMA的MNa+峰为主要峰。在第二套实验中，PS和PMMA的体积比从1:0到1:9，基质是蒽三酚/Ag也就是PS的最优化条件。在所有混合物实验中，PMMA是主要离子，而PS仅以相

10、对干PMMA为10%的峰出现，质谱图上主要是PMMA的峰。当然，这种有利于PMMA的歧视效应也许可以用来检测PS中中痕量的PMMA但是从这些结果中也可看出，用MALDI分析高分子混合物还要走很远的一段路。,15,4、嵌段型高分子分析 嵌段共聚物之中嵌段和组成分布对于聚合物的最终性能有重要的影响。MALDI-TOF-MS也可以成功地应用于嵌段型高分子的研究。Dams等人用MALDI分析了-甲基苯乙烯和乙烯基吡啶的嵌段共聚物。 Wilezek-Vera等MALDI-TOF MS与1H NMR相结合，对苯乙烯/-甲基苯乙烯嵌段共聚物进行研究，测定了该共果物的组成分布和嵌段长度，我们研究组研究了荣乙二

11、醇和聚苯乙烯的嵌段共聚物。用MALDI/TOF测得的分子量和以GPC测定的结果参见表。 从表中可以青出，对干这类窄分布的高分子化合物，MALDI/TOF所得结果与GPC法所得结果比较接近。但是MALDI/TOF法更加迅速、方便，具有显著的优越性。,GPC法和 MALD/TOF MS法测得的分子量比较,16,5.2 药物的质谱分析,一、生物活性物质分析1、天然产物分析各种提取物的分析，HPLC/MS联用分析,17,Methanolic 根部提取物,LC-UV (215 nm),18,LC-MS, 基峰离子流图,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,Time (min),0,5,10

12、,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,Relative Abundance,9.49,4.81,4.58,17.88,11.89,6.72,19.08,19.55,3.16,17.01,14.39,13.69,2.14,15.40,8.10,10.87,20.02,6.25,7.97,5.09,3.54,21.42,1.07,Unknow,水-甲醇梯度 0.25 mL/min, C-18 Column 20 uL 进样,19,58,0,10,20,30,40,50,100,0,10,20,30,40,50,60,70,8

13、0,90,Relative Abundance,473.1,493.7,460.8,386.5,300.2,487.1,400.3,RT: 9.21-9.61 AV: 8 NL: 1.28E6,RT: 11.78-11.94 AV: 4 NL: 7.42E5,?,负离子ESI全扫描质谱图(Full Scan MS), +14 u,Unknown 1,20,144.9,211.7,275.2,225.8,164.0,255.9,244.5,281.5,324.9,293.3,307.2,193.3,325.8,219.2,179.3,294.3,308.3,131.5,200.5,159.9,2

14、76.1,265.4,233.3,334.5,246.5,155.0,285.1,m/z 293,310.9,O,O,O,H,O,H,O,O,H,O,H,O,H,O,H,Negative Ion ESI Data Dependant MS/MS Spectra,Unknown 1, +14 u,m/z 179,21,58,0,10,20,30,40,50,100,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,Relative Abundance,473.1,493.7,460.8,386.5,300.2,487.1,400.3,RT: 9.21-9.61,AV: 8 NL: 1.2

15、8E6,RT: 11.78-11.94,AV: 4 NL: 7.42E5,Proposed Echinacoside Structure at m/z 487,增加一个亚甲基,22,15.40,8.10,10.87,6.25,7.97,5.09,3.54,21.42,1.07,Proposed Echinacosides,Confirmed Echinacoside,On-The-Fly Analysis !,23,大脑促眠素的发现与确证,从猫脑袋中取出脑髓液，用液相色谱分离各组分，用电喷雾串联质谱、气质联用、薄层层析、红外及核磁确定各组分的化学结构，目的是找出与睡眠规律有关的物质。 在猫睡眠

16、周期的不同时间点采取脑髓液样品，测定各样品的紫外吸收光谱，发现猫在处于即将入睡状态时，脑髓液试样有一个特别显著的紫外吸收峰。 电喷雾四极杆串联质谱分析各样品的色谱峰中有显著差异的组分，发现m/z282的离子。并证明是MH+离子，用快原子轰击磁质谱测得其分子式为C18H35NO。CID实验：m/z282的MS2和MS3。在低质量范围，m/z282的子离子谱显示长链烷烃的特征。质量数为17和35的中性丢失是母离子m/z282电离产生子离子m/z265，m/z247时产生的。在以上质谱分析的基础上，综合其它分析手段的表征结果，初步推测出这种催眠素的结构为 顺-9,10-十八碳烯酰胺。该化合物的合成和

17、结构表征证实这一结构推测是正确的。,24,大脑促眠素的MS/MS,质谱确定大脑促眠素的化学结构,脑髓液中分离出的促眠素化学结构,25,结构分析：确定代谢途径，微量条件下进行。定量分析：确定生物利用度等，在复杂本底的条件下测定。,?,parent,例：一种非胰岛素依赖型糖尿病药物的代谢分析(Non insulin dependent diabetes drug),代谢物是有效的还是有害的?,二、药物代谢分析,LC/MS/MS技术,26,Time (min),Relative Abundance,Glyburide 代谢物,10 x,On-line LC-MSn,27,m/z,Relative A

18、bundance,510,512,222,199,279,241,123,391,532,176,399,369,Full scan MS Spectrum of peak at 8.72 min,On-line Data-Dependant LC-MSn Trigger Mass,28,On-line Data-Dependant LC-MS2,29,On-line Data-Dependant LC-MS3,30,m/z 369,m/z 395,m/z 352,m/z 304,m/z 288,m/z 169,O,m/z 510,m/z 492,MS1,MS2,MS3,Fragmentati

19、on Scheme,31,三、远电荷碎裂反应(Charge-Remote Fragmentation) 远电荷碎裂：断裂发生在远离电荷的位置，与质谱解析一章中裂解均与电荷或自由基有关不同。主要原因是这种远电荷碎裂反应发生在具有较长的碳链化合物中，如长链脂肪酸、胆汁酸、类固醇等。 远电荷碎裂反应在蛋白质分析中有时也会发生。 研究方法：高能、中能、低能碰撞诱导解离MS/MS质谱。 高能碰撞：210kV，磁质谱仪上，TOF/TOF等。 低能碰撞: 100V以内，四极杆质谱仪，离子阱质谱仪。 中能碰撞： 1001000V， 扇形电场磁场/TOF联用质谱(特制质谱)。,32,1、远电荷碎裂的主要反应机理

20、 长链饱和化合物 1,4氢消除反应 (1) 两步均裂反应 (2) 产生荷基异位离子 末端不饱和离子 长链不饱和化合物,(a) 近烯丙基键，记作Ap断裂， Proximal allyl bond。远烯丙基-乙烯基键 distal allylvinyl bond, Avd近烯丙基-乙烯基键，记作Avp断裂， proximal allylvinyl bond。 X = O+ 或 OLi2+。,33,13-羰基-十八烷酸，12-羰基-十八烷酸的远电荷碎裂谱图,34,十八烷酸CID-MIKES谱图，M-Ht2Li+ (A) 4,7-二烯十八烷酸, m/z 293 (B) 6,9-二烯十八烷酸 m/z 2

21、93,高能碰撞, 6kV给出较多的信息，常用的远电荷碎裂的方法。,35,长链脂肪酸M-H+离子的ES-MS/MS 谱图 (a) 硬脂酸， m/z 283; (b) 油酸, m/z 281; (c) 亚油酸, m/z 279. 谱图采自于AutoSpec-OATOF仪器。碰撞能量400eV，Xe用作碰撞气体。,中能碰撞，400eV特殊设计的仪器上实现，有较多的信息。,36,低能CID谱，M-Ht2Li+，(4,7,10,13,16,19)-六烯二十二烷酸 (docosahexaenoic acid, m/z341)。,低能碰撞，400eV信息较少，特殊情况使用。,37,5.3 糖类的质谱分析,糖

22、：生命体的能源供给者，传统的认识。糖的生物活性：与蛋白质、脂质、磷酸脂结合成“糖复合物” (glycoconjugate)，血浆、酶、激素及细胞外膜均有含糖蛋白。糖复合物参与细胞的识别、增生、分异；维持生物体的免疫系统、生殖系统、神经系统和新陈代谢平衡。 寡糖和多糖具有增强免疫力，抗辐射、抗肿瘤活性，成为药物，中药应用，生物多糖，保健药物，保健品。糖结构的复杂性：单糖的组成为CnH2nOn (n=39)，其中n=5和6最为常见。每个单糖有多个手性碳原子。有链式结构和环式结构。 寡糖和多糖的糖链是由含多元羟基的环状己糖或戊糖通过苷键连接而成。各羟基环上有顺反异构体，各单糖分子上有五个手性碳，连接

23、的位置和构型多种多样。,38,糖类分析的困难性： 强极性，分离难，HPLC峰形不好。连接方式复杂，立体化学复杂。同系物多，糖苷键弱，复杂混合体系。电离效率不高、种类有限。,16种单糖的常见结构,一、单糖及多糖的结构,39,9,葡萄糖醛酸GlcA,10, 鼠李糖L-吡喃鼠李糖Rha,11, 乙酰神经氨糖酸NeuNAc,12,胞壁酸2-氨基-3-氧-(1-羧乙基)-2-脱氧-D-葡萄糖 Mur,14, 鸡纳糖6-脱氧- -D-葡萄糖,15, 泰威糖Tyv,16, D-果糖Fru,一个典型的双触角氮连接多糖的结构特征,触角,核心区,40,二、质谱分析电离方式：FAB：传统的电离方法，主要集中于低聚寡

24、糖的分析。ESI：对于常规的ESI，天然多糖的电离不如肽和蛋白，纳升喷雾可以改善电离效率，可以达到与肽和蛋白相当的程度。寡糖的亲水性限制了ESI雾滴的表面活性，灵敏度低。纳喷雾雾滴小，可以突破亲水性的限制，灵敏度显著升高。多糖的衍生化，减小亲水性，可提高灵敏度，导致灵敏度提高的是表面活性的增加，而不是样品的挥发性。 MALDI：低聚物糖的电离效率基本与分子量无关。由于糖的不稳定性，MALDI电离时会产生某些分解，尤其会产生亚稳离子分解，可以用源后解离(PSD)技术测定亚稳离子，但会使谱图变得复杂。,多糖碎片代号表示法非还原端用A, B, C表示。还原端用X, Y, Z表示。左上角标表示，环中两

25、根断裂键所连碳原子的编号(从环上氧原子开始计数，红色数字)，右下角的数字表示残基的序号。,41,42,43,44,Human Genome Project,5.4 核苷酸(Oligonucleotide)的质谱分析,Understanding The Genome To Fight The Disease Y2K Drug Design,45,500,600,700,800,900,1000,1100,1200,m/z,0,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,Relative Abundance,919.1,9

26、15.4,1098.6,1102.9,787.8,1107.3,922.5,784.5,686.1,790.6,817.1,1147.9,689.1,851.6,691.7,956.7,609.9,1070.7,1064.7,905.3,768.7,617.3,1153.7,1061.7,720.3,959.3,664.8,901.7,1174.3,1040.0,590.0,549.1,522.1,Negative Ion ESI Of 18 mer (200 fg/uL),进样速度： 3 uL/min 乙腈-甲醇-丙酮 (70:20:10,v/v/v, 5% TEA) 毛细管温度: 100

27、C,OLIGO22 # 209-213 RT: 1.96-1.99 AV: 5 NL:1.49E5T: - p Full ms 450.00-1200.00,46,OLIGO22,#,217-225,RT:,2.03-2.09,AV:,8,NL:,1.63E5,T:,- p Full ms 450.00-1200.00,650,700,750,800,850,900,950,1000,1050,1100,m/z,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,Relative Abundance,1102.9,1098.6,918.8,915.4,787.5,784.5,68

28、9.3,686.4,611.2,-5,-6,-7,-8,Negative Ion Charge States of 18 mer,47,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,Relative Abundance,5520.0,5498.0,5541.0,5565.0,5745.0,4788.0,5972.0,5579.0,5385.0,5017.0,5221.0,4908.0,5116.0,6086.0,5762.0,6206.0,4821.0,GATTCGTAGCTACGAATCReported Avg. Mol. Wt: 5500Monoisotopic Mas

29、s: 5497.7,Negative Ion Deconvoluted Spectra,48,Negative Ion MS2 Spectra of the - 5 and -7 Charge States,49,5.5 蛋白质分析一、氨基酸和小肽,小肽断裂碎片离子定义,50,研究小肽的结构：MS/MS分析例：一个五肽的分析 具有保护基的五肽的一级结构： BOCGlyAlaDValLeuIleOBz BOC = t-Butyloxy carbony, Bzl = benzyl.,yn = yn,51,各离子的生成途径 MH-56+ McLafferty重排,MH-100+,52,bn系列离子,

30、yn系列离子, yn = yn + 2,53,bn和yn系列离子生成的另一种机理,54,20种氨基酸残基（NH-HCR-C=O）和羟胺正离子的质量,55,500,600,700,800,900,1000,1100,1200,1300,1400,1500,1600,1700,1800,m/z,0,100,%,998.2,942.7,893.2,848.6,808.3,616.2,771.5,738.0,617.2,1060.5,999.6,1131.1,1061.8,1211.8,1132.5,1137.5,1305.0,1413.7,1541.9,1696.3,16000,17000,1800

31、0,m/z,0,100,%,16951.4,去卷积deconvolution,20 fmole 马心肌红蛋白 (Horse Heart Myoglobin) ESI 质谱图,二、蛋白质分析,56,原始数据,去卷积混合物：主要两种,beta lactuglobulin,57,人血红蛋白 MALDI-TOF 质谱图,58,鸡蛋溶菌酶ESI质谱图,59,m/z1 = 895,m/z2 = 945,肌红蛋白ESI质谱图,60,5.6 蛋白质组学及应用,什么是蛋白质组？ 由基因组，细胞或组织所表达的所有蛋白质成分。 蛋白质组的重要性 研究基因组功能的重要途径。 药物目标 - 在分子水平研究健康和疾病的相

32、关。,蛋白质组学是一门在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的新兴学科。 蛋白质组学的终极目标是测定生物物种的所有生命活动中的所有蛋白质。,Why蛋白质组学?,mRNA表达水平不能预测蛋白质表达水平 蛋白质的修饰和加工不能从基因序列直接推导 蛋白质组是动态的并反映生物系统的状态,61,蛋白质组学面临的挑战 蛋白质没有可进行量的放大方法(如DNR的PCR方法)。 在生物处理过程中蛋白质是高度动态变化的。 物理化学性质的多样性。 动态范围的挑战：相对含量超过106范围(血清中可达1012),质谱测量在蛋白质组学中的作用 质谱是肽(不是蛋白质)的一级序列分析的最普遍和最有效的工具。 质谱是一种

33、精确的定量工具，尤其是内标法定量(如对同位素比的 测量)。 质谱在确定蛋白质高级结构时不是很有效。 质谱对已知肽和蛋白质重复定量分析不是很有效。,62,经典的氨基酸序列分析方法N端氨基酸单元的分析 最常用的有下列两种方法：桑格尔(Sanger F)方法：利用肽链N端游离氨基与2,4二硝基氟苯(DNP)发生芳香亲核取代反应，而将 肽链上的氨基酸逐个分解。埃德曼(Edman)方法：用异硫氰酸苯酯(PITC)和N端的 游离氨基反应，将肽链上的氨基酸逐个分解。 C端氨基酸单元的分析：通过羧肽酶催化水解用特定的酶催化使含某种氨基酸的肽键部位水解经典分析方法的缺点 工作量大、测序速度慢、样品用量大。,63

34、,蛋白质的二维分离,64,仪器鉴定率肽质量指纹谱 MALDI 50% (Peptide Mass Fingerprinter, PMF )多肽序列标签 LC/MS/MS 80% (Peptide Sequence Tag, PST)从新测序LC/MS/MS 80% (De Novo)蛋白质及混合物的定量分析：同位素编码亲和标记 (Isotope-Coded Affinity Tags, ICAT),蛋白质序列研究的三个层次,65,蛋白质组研究技术路线,样品(组织、细胞等),凝胶图象分析,蛋白质鉴定,二维数据库,酶解,HPLC-MS、MS/MS,数据库检索,二维凝胶电泳,酶解,肽混合物,MS、M

35、S/MS,肽指纹谱,肽序列标签,从新测序,66,一、肽质量指纹谱(Peptide Mass Fingerprinter, PMF) PMF测定速度快。 PMF灵敏。 PMF需要完整和准确的蛋白质序列数据库。,67,分离的酶解的蛋白质,96/384位样品靶,数据处理和数据库检索,质谱样品的准备,MALDI质谱分析,蛋白质一级结构结果,PMF方法的一般流程,68,洗胶/去污 脱水 减少S-S键 洗涤/脱水,1、In-gel 酶切/消化,Multiprobe (4x96 Well Plat) 样品体积0.5-100 L 板上加热和冷却 消化板加热 37oC 肽存储在-4oC冷却板 酶试剂存储在-4o

36、C冷却板,修正-SH基 加入trypsin溶液 5-12小时 肽提取,2、质谱分析样品的制备,灵敏度： 500fmoles BSA in-gel。 移液和消化时间8小时(1x96 well plat)。 最多可进行4x96 well plat的同时消化。,基本能力,69,3、质谱测定,设这检索的条件，不同软件有不同的参数和用法。,MALDI-TOF 质谱测定,4、数据库检索,70,样品1,样品2,样品3,数据库检索结果： 带*号的峰为与数据库中的峰相匹配的峰。样品1：甘油醛-3-磷酸脱氢酶样品2：遍在蛋白羧酸基末端水解同工酶样品3：丙糖磷酸异构酶,71,PMF 实验，同一点上经常是蛋白质的混合

37、物,Some proteins are identified with high confidence,Some proteins are identified with high confidence,Some proteins are identified with low confidence,Row data,72,And there are still peptides unassigned to a protein,Final result,73,74,二、多肽序列标签(Peptide Sequence Tag, PST)和肽阶梯序列(Peptide Ladder Sequenci

38、ng),1、肽序列标签 蛋白质的常见氨基酸有20 种，一般3 个氨基酸的肽段碎片将有8000种可能的排列方式4 个氨基酸将有160000种排列方式，因此即使对于不是很大的原核生物的蛋白质组来说，一个短的序列片段也具有很高的特异性。 肽序列标签：一个多肽的部分氨基酸序列和该肽的质量以及该肽未测序部分的质量。,Mann M. et al, Anal. Chem., 1994,66,4390 for PSTMann M. et al, Trands in Biochem. Sci., 1996,21,494.,75,例：马心肌红蛋白鉴定 马心肌红蛋白胰酶酶切产物的ESI-Q-TOF肽指纹谱,76,马

39、心肌红蛋白胰酶酶切肽段m/z908.4(双电荷离子)的MS/MS谱图,肽序列标签：,GLSDGE WQQVLNV WGK,y10,1257.8,y3, 390.3,C端,N端,WQQVLNV W,Y3,390.3,y10,1257.8,检索结果：,77,N端 YAM IGD PTGALR C端,y10,1000.5,y7, 715.4,例： m/z为691.43Da(M2+)，质量数为1380.6Da。 MS/MS图,肽序列标签：检索结果：来自乙醇脱氢酶,715.4(DGI)1000.5,78,2、肽阶梯序列(Peptide Ladder Sequencing) 梯状测序法(ladder se

40、quencing)：用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，相互间差一个氨基酸残基的系列肽，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基，与Edman法相似。,AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn,PTC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AanPC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn,PITC + 5% PIC,ATZ(AA1) + AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn,Acid (TFA),after m cycles,Further cycles (without

41、 separation),PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn PC- AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn PC-AA3-AA4-AA5- -AAn PC-AA4-AA5- -AAn PC-AAm- -AAn,一步MALDI-MS,阶梯序列数据,B. Chait et al., Science 262, 89, 1993.,原理：,79,血纤维蛋白肽:,Protein ladder Sequencing Glu1fibrinopeptide B,80,81,82,可选择性的碎裂方式： 光诱导解离(UV-193nm) 相当于高能CID。 多光子电离(IR-10.6m)

42、 相当于低能CAD。 表面解离(SID) 相当于低能CAD。 电子捕获解离(ECD) c和z类型碎片增强。注：这些方法在自动化大批量实验中并不是常规的方法。,数据库搜索为什么会失败 蛋白质不在数据库里或者不正确的搜索参数(酶特征，分类法等等)。 在数据库里蛋白质表达不正确(DNA核苷酸序列，基因内区序列等等预测失败)。 蛋白质变性. - 变性的氨基酸残基 - N端和C端的变化：蛋氨酸的形成，序列信号变化，C链缩短 - 可变的序列(同族以及选择性结合的变体) - 后修饰变化(糖基化，磷酸化等) - 不希望的化学诱导修饰(在尿素中氨甲酰化) 搜索引擎不够完善成熟。,83,三、重新测序(De nov

43、o sequence),数据库中没有的蛋白质分析 样品来源于非序列化基因组 蛋白质经多重高度修饰 在实际生物体中，非同寻常的酶活性 处理古生物样本，样品处理时肽被修饰(污染) 合成肽,重新测序的原因,谱图的预处理多电荷峰转化成单电荷峰多同位素峰转化成担同位素峰简化谱图提高信噪比,84,谱图处理,谱图分析,85,16O/18O C端标记 为了提高对串联质谱数据的解读能力，尤其是对y和b型离子系列的辨别能力，用化学修饰方法使辨别更容易。 16O/18O C端标记：在蛋白质酶解时，酶解液中H218O和H216O各占50%，酶解后肽段羧基端上的羟基氧18O/16O的(M+2/M)同位素丰度比高于正常的

44、峰强度，据此可以分辨出y系列离子。,给出C-端离子的唯一特征碎片离子,86,de novo 序列解释马尔可夫链蒙特卡洛(Markov chain Monte Carlo) de novo 序列产生算法贝叶斯规则(Bayesian)断裂方式和谱图匹配算法,Beta 牛乳糖 m/z 841.5 的MS/MS谱,87,m/z 841.5 MS/MS 谱的测序结果,88,同位素亲和端: ICAT试剂，重氢和正常氢的样品。细胞中蛋白质被还原后，分别用含重氢和正常氢的ICAT试剂与之作用， ICAT试剂标记蛋白质中的半胱氨酸的巯基。将两份蛋白质溶液混合，然后用任何方法提取分离。蛋白质用胰蛋白酶酶切。亲和色

45、谱对肽分离。用各种质谱方法(MS, MS/MS等)分析。通过同位素比例进行定量分析，通过碎片分布提供鉴定信息。,四、同位素编码亲和标记 (Isotope-Coded Affinity Tags, ICAT),89,使用可分裂的ICAT试剂对蛋白质的定量和鉴定分析,MS Data,90,混合后胰酶消化,细胞状态一,细胞状态二,提取蛋白，还原后用ICAT的轻链12C标记,提取蛋白,还原后用ICAT的重链13C标记,典型的ICAT试剂工作流程,91,基于稳定同位素标记定量的标记蛋白质方法 化学标记(ICAT,N末端,以及其他残留物末端) 优点：一般都能适用(组织结构，细胞等) 同位素富集的生长机理(

46、15N) 不需要任何化学干涉, 但不能应用于组织样品，峰对之间的质量 差可变。 新陈代谢标记（12C精氨酸） 不需要任何化学干涉，但不能应用于组织样品。,92,五、蛋白组学方法的应用,1、生物的蛋白质组及其数据库 简单生物的蛋白质组：完全测定或大部分测定蛋白质序列，如细菌、支原体、酵母等。相对复杂的高等生物：线虫、水稻、小鼠及人类：局部或功能蛋白质组学。相关的数据库的建立和完善。Langen建立了流感嗜血杆菌的双向数据库。2、生物过程生理机制的研究大肠杆菌中蛋白质折叠的过程中新生肽段与分子伴侣的作用：首先利用免疫共沉淀得到胞质中所有的与分子伴侣GroEL结合的肽链，然后用双向电泳等方法对这些肽

47、链进行鉴定。吞噬体的蛋白组分析: 140种蛋白，其在细胞吞饮/吞噬作用途径中的作用是以前人们所未曾预料到的。,93,3、蛋白质的相互作用 作为细胞蛋白复合物和传导途径的基本要素，蛋白之间的相互作用对蛋白的功能实现起着关键的作用。用酵母双杂交系统研究线虫生殖器的发育过程。利用27 种已知的与线虫发育有关的蛋白，通过大规模地研究其相互作用，确证了100多个蛋白间相互作用。 人类胃病病原体幽门螺旋杆菌的大规模蛋白间相互作用图谱。基于蛋白组学高通量的筛选策略，利用酵母双杂交系统筛选了261种幽门螺旋杆菌蛋白，确认了蛋白间的1200种相互作用，从而将46%的蛋白组有机地联系起来。用酵母双杂交技术对酵母的

48、近6000种蛋白之间的相互作用进行了大规模的全面研究。通过阵列筛选和文库筛选结果的对比，发现前者更为有效而后者通量更大。对酵母蛋白间的2709 种相互作用进行了全面的分析，建立了一个包含1548种蛋白以及2358种蛋白间作用方式的巨大网络。,94,4、疾病研究肝癌：分析人肝肿瘤细胞系HCC-M的蛋白组，鉴定其中400种蛋白。结合正常人肝组织的蛋白组图谱，可寻找到差异蛋白。BEL-7404对人肝癌细胞系与正常人肝细胞系L-02的双向电泳图谱的差异分析，找到了99个差异蛋白点，用离子阱质谱对其中的12个点进行鉴定。前列腺癌肿瘤：人体组织和体外培养前列腺细胞系的蛋白组进行对比，通过差异谱分析寻找差异

49、蛋白，为寻找前列腺癌的治疗靶蛋白和标记蛋白打下了良好基础。,95,六、蛋白芯片-蛋白指纹图,96,Organic,Detergent,Salt,Water,pH,Urea,CHAPS,Imidazol,洗脱条件Wash Conditions,芯片表面类型 Surface Type,飞行质谱检测Measured m/z,化学表面芯片的蛋白质剖析：三维分离,97,血清白蛋白的分离鉴定,血清白蛋白 pI 5.5pH 4.5 + 净电荷 pH 5.5 no 净电荷 pH 8.5 - 净电荷 Transferrin铁传递蛋白 pI 6.5pH 4.5 + 净电荷 pH 5.5 + 净电荷 pH 8.5 - 净电荷,Transferrin,98,蛋白指纹图谱仪芯片阅读器,电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱仪精确地测定质量分析范围广，敏感性高,99,Difference map,PatientControl,GelViewTM,蛋白指纹图谱的发现,