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1、毕 业 论 文（设计）题 目 竹叶黄酮提取物的抑菌活性研究 指导老师 专业班级 生物技术及应用1 姓 名 学 号 2010年5月31 日摘要本论文采用稀释法研究了竹叶黄酮提取物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），并采用滤纸片法对竹叶黄酮提取物及其水解产物的抑菌活性进行了对比研究。试验结果表明竹叶黄酮提取物对藤黄微球菌、沙门氏菌、马红球菌、痢疾志贺氏菌、柠檬酸杆菌的抑菌效果及杀菌效果较好，其中竹叶黄酮提取物水解产物对藤黄微球菌的抑菌杀菌效果尤为明显，最小抑菌浓度为1.953mg/mL。提取物对大肠杆菌抑菌作用很弱。竹叶黄酮甙元的抑菌效果要优于黄酮苷，因此在抑菌方面应该注重竹叶黄酮水
2、解产物的开发。关键词：竹叶黄酮提取物；水解；抑菌；藤黄微球菌目 录引言. 11实验材料.11.1原料.11.2仪器. .21.3培养基 .21.4微生物 .22实验方法.22.1芦丁标准曲线制作及黄铜含量测定.22.2试验药品制备 .32.3菌种活化 .32.4抑菌活性测定 .32.5最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定.33结果与分析 .43.1芦丁标准曲线及其提取物、水解产物含量测定. .43.2抑菌活性初步测定. 43.3最低抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC）测定.54小结与讨论 . 7参考文献 .9引言竹子属于禾本科竹亚科(Bambusvudea)的一类植物，已
3、知全球约有150属。l 225种，竹林面积达l 400万hm2。中国是世界竹子中心产区之一，竹林面积400万hm2，主要分布在华南、西南地区及华东的福建、浙江、江西、台湾和华中的湖南、湖北等省1。我国江南竹资源丰富，竹子、竹笋被充分利用，我国少数民族地区还有饮用竹筒茶、竹叶茶，吃竹米饭的习惯2。竹叶在我国有悠久的利用历史，是一味传统的清热解毒药。其药效在本草求真、本经逢源、药品化义、 经曰等古籍和现在的中药大辞典中均有记载3。此外，长江中下游地区的人民，自古以来就有用竹叶包粽子的习惯，而西南地区除用粽叶芦的叶子外，也用龙竹等竹叶包粽子，日本人喜欢用竹叶包食品。可谓竹子一身都是宝。随着科学的发展
4、，竹叶越来越多地被人们利用起来了。近几年研究表明竹叶中含有大量的黄酮类化合物和生物活性多糖及其他有效成分，如酚酸类化合物、蒽醌类化合物、萜类内酯、特种氨基酸和活性肽、锰、锌、硒等物质。竹叶中所含的功能因子主要是黄酮类化合物，即所谓竹叶黄酮。有研究表明：竹叶黄酮主要是黄酮糖苷，并以甙为主，4种主要的竹叶碳甙黄酮分别是荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷4。竹叶黄酮具有抗衰老，抗应激，抗疲劳，调节血脂，阻断亚硝化反应，增强免疫能力，抗菌、抑菌等作用5。现在在医学临床上抗菌大量使用抗生素，而抗生素的大量使用导致了人类机体的抗药性，更导致大量细菌变异，许多抗生素产生了抗药性。现在许多领域都在寻找纯天然的
5、抗菌药物。本文对竹叶黄酮及其水解产物的抑菌抗菌效果的对比试验进行研究。1 实验材料1.1 原料 竹叶提取物（总黄酮40）购于金华贝康生物科技开发有限公司。1.2 仪器立式自动电热压力蒸汽灭菌锅（LDZX-40BI型，上海申安医疗器械）电热恒温鼓风干燥箱（DGG-9140B型，上海森信实验仪器有限公司）数显电热恒温培养箱（303A-4，上海汇三贸易有限公司）电热恒温水浴锅（DK-S24型，上海精宏实验设备有限公司）医用超净工作台（YJ-875，苏州三兴净化设备有限公司）华日冰箱(BCD-227C，杭州华日电冰箱股份有限公司)循环水真空泵（SHB-3，郑州合众仪器有限公司） 电子天平（TD.100
6、01，上海长城华美仪器化剂有限公司）1.3 培养基营养琼脂（青岛海博生物）、营养肉汤培养基（杭州微生物试剂有限公司）1.4 微生物藤黄微球菌（Gambogic micro aureus）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）乙型副伤寒沙门氏菌（S.paratgphi B）马红球菌（Rhodococcus equi）痢疾志贺氏菌（Shiga diarrhea）大肠杆菌（Escherichia coli）柠檬酸杆菌（Citric acid bacteria）黑曲霉（aspergillus ）以上菌种由浙江省水产技术推广总站，浙江省水产质量检测中心提供。2 实验方法2.1 芦丁
7、标准曲线制作及黄酮含量测定以芦丁标准品为对照品，精确称量芦丁标准品0.0313g，用30乙醇溶液溶解并定容成100mL，摇匀即得浓度为0.313mg/mL标准溶液。分别移取1、2、4、6、8、10mL标准溶液于50mL容量瓶中，补加30乙醇至25mL，加1.4mL5NaNO2 溶液，5min后加1.4mL10Al(NO3)3 溶液，6min后加10ml1mol/LNaOH溶液，最后用30乙醇溶液定容，混匀，显色10min后于510nm处测得吸光度（此波长通过众多文献得出的最佳吸收波长），同时以空白为参比6。样品测定时用同样的方法。2.2 试验药品的制备准确称取竹叶总黄酮粉末5.00g溶于40m
8、L40的乙醇溶液，作为1号储备液。准确称取黄酮10.00g于圆底烧瓶中加入100mL30盐酸溶液溶解，在50水浴锅中冷凝回流水解1h，抽滤，再用水洗去盐酸，固体用20mL40乙醇溶液溶解，用分光光度法测出其浓度，根据浓度配置出和1号储备液同浓度的溶液作为2号储备液7,8。2.3 菌种活化分别将藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、乙型副伤寒沙门氏菌（S.paratgphi B）、马红球菌（Rhodococcus equi）、痢疾志贺氏菌（Shiga diarrhea）、大肠杆菌（Escherichia coli）、柠檬酸杆菌（Citric acid bact
9、eria）从4冰箱取出升温至室温，然后接种于营养琼脂斜面培养基上，于 361下培养24h进行活化培养，传二代 。分别取活化并传代培养好的菌株，用无菌生理盐水将菌苔洗下，采用比浊法用0.5麦氏比浊管对比配制菌体悬浮液，使菌悬液菌数为 1.50108个/mL。2.4 抑菌活性测定抑菌活性测定利用滤纸片法，将滤纸片在储备液中浸泡1小时后置于无菌环境晾干备用。分别在营养琼脂培养基中加入0.1mL的已配好的菌悬液，用涂布棒涂布均匀，将晾干的滤纸片放在相应位置。用无菌水浸泡的滤纸片做空白对照。在361下培养24h9。2.5 最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定提取物进行二倍稀释。取10支无
10、菌试管，各加营养肉汤1mL，第1管加储备液1mL，混匀后取1mL于第2管，混匀后吸取lmL于第3管，依次类推到第9管，弃去1mL，第10管改加1mL无菌生理盐水作为对照，然后每管内加入菌悬液01mL混合均匀，361培养24h。结果判定：肉汤清亮透明表示细菌不生长(-)，肉汤浑浊表示有细菌生长(+)。能抑制细菌生长的提取物最高稀释度作为其最低抑菌浓度。将其继续于361培养24h观察肉汤透明度。澄清不长菌的最高稀释度就是最小杀菌浓度10,11。3 结果与分析3.1 芦丁标准曲线及其提取物、水解产物含量测定通过芦丁标准标准曲线法作标准曲线如下图：图3.1 芦丁标准曲线由图3.1得芦丁标准曲线线型方程
11、为y = 11.89x + 0.0074 相关性R2=0.9994。通过同样方法测得竹叶提取物吸光度值代入线型方程中得出总黄酮含量为40，竹叶提取物水解产物总黄酮含量也为40。3.2抑菌活性初步测定用竹叶提取物、竹叶黄酮储备液及其水解产物对一些常见菌和致病菌做平板扩散实验。实验结果如表3.1。从表3.1可以看出竹叶提取物对金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌抑菌效果最佳，对乙型副伤寒沙门氏菌、马红球菌、柠檬酸杆菌、藤黄微球菌抑菌效果次之，对大肠杆菌抑菌效果不理想。竹叶提取物水解产物对藤黄微球菌抑菌效果最佳，其次依次是金黄色葡萄球菌、柠檬酸杆菌、马红球菌、乙型副伤寒沙门氏菌，对大肠杆菌抑菌效果也不理想。
12、两种药品均对黑曲霉没有抑菌效果。竹叶提取物水解成分对藤黄微球菌抑菌效果优于提取物。同时在对金黄色葡萄球菌、柠檬酸杆菌、马红球菌、乙型副伤寒沙门氏菌这些抑菌效果也略优于提取物本身。表3.1 竹叶提取物及其水解产物对被测细菌的作用菌种名称抑菌圈大小（mm）竹叶提取物竹叶提取物水解产物藤黄微球菌10.0213.10金黄色葡萄球菌12.3612.43乙型副伤寒沙门氏菌11.5611.42马红球菌11.2311.64痢疾志贺氏菌12.1812.33大肠杆菌8.237.98柠檬酸杆菌11.7812.00黑曲霉00*以上结果均为三次平行试验平均值3.3最低抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度(MBC)测定采用营
13、养肉汤培养基两倍稀释法，培养24h和48h后观察培养基的混浊情况。试验结果如下：表3.2 竹叶提取物中总黄酮对被测细菌的抑菌作用菌种名称竹叶提取物中总黄铜最低抑菌浓度（MIC）62.5mg/mL31.25mg/mL15.625mg/mL7.8125mg/mL3.906mg/mL藤黄微球菌-+金黄色葡萄球菌-+乙型副伤寒沙门氏菌-+马红球菌-+痢疾志贺氏菌-+大肠杆菌-+柠檬酸杆菌-+“+”为有细菌成长 以上活菌数都为比浊法测得的，0.5麦氏即为1.50108个/mL由表3.2可以看出：竹叶提取物对被测细菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为藤黄微球菌15.625mg/mL，金黄色葡萄球菌7.8125
14、mg/mL，乙型副伤寒沙门氏菌7.8125mg/mL，马红球菌7.8125mg/mL，痢疾志贺氏菌7.8125mg/mL，大肠杆菌62.5mg/mL，柠檬酸杆菌7.8125mg/mL。其中对大肠杆菌抑菌所需浓度最高，故竹叶提取物对大肠杆菌抑菌效果不理想。表3.3 竹叶提取物中总黄酮的最小杀菌浓度菌种名称竹叶提取物中总黄铜最小杀菌浓度（MBC）62.5mg/mL31.25mg/mL15.625mg/mL7.8125mg/mL3.906mg/mL藤黄微球菌-+金黄色葡萄球菌-+乙型副伤寒沙门氏菌-+马红球菌-+痢疾志贺氏菌-+大肠杆菌-+柠檬酸杆菌-+表3.4 竹叶提取物中总黄酮水解产物的最小抑菌
15、浓度（MIC）菌种名称竹叶提取物中总黄酮水解产物的最小抑菌浓度（MIC）62.5mg/mL31.25mg/mL15.625mg/mL7.8125mg/mL3.906mg/mL藤黄微球菌-金黄色葡萄球菌-+乙型副伤寒沙门氏菌-+马红球菌-+痢疾志贺氏菌-+大肠杆菌-+柠檬酸杆菌-+由表3.3可以看出：竹叶提取物对被测菌的杀菌浓度中，金黄色葡萄球菌效果最为明显，对乙型副伤寒沙门氏菌、马红球菌、痢疾志贺氏菌、柠檬酸杆菌的杀菌浓度差不多。由表3.4可以看出：竹叶提取物中总黄酮水解产物对藤黄微球菌抑菌效果明显，在低浓度下仍然有很好的抑菌效果。其次是对乙型副伤寒沙门氏菌、马红球菌、痢疾志贺氏菌、柠檬酸杆菌
16、。同样，总黄酮水解产物对大肠杆菌抑菌效果不明显，在总黄酮水解产物较高浓度下，细菌仍生长良好。表3.5 竹叶提取物中总黄铜水解产物最小杀菌浓度（MBC）菌种名称竹叶提取物中总黄酮水解产物最小杀菌浓度（MBC）62.5mg/mL31.25mg/mL15.625mg/mL7.8125mg/mL3.906mg/mL藤黄微球菌-+金黄色葡萄球菌-+乙型副伤寒沙门氏菌-+马红球菌-+痢疾志贺氏菌-+大肠杆菌-+柠檬酸杆菌-+由表3.5可以看出：竹叶提取物总黄酮水解产物对被测菌的杀菌浓度中，对大肠杆菌效果不够明显，而对藤黄微球菌、乙型副伤寒沙门氏菌、马红球菌、痢疾志贺菌和柠檬酸杆菌的效果都比较明显。综合各表
17、看出竹叶提取物水解处理产物的抑菌及其杀菌能力略大于竹叶提取物，两种药品对大肠杆菌的抑菌效果均不明显，对黑曲霉均没有抑菌效果。4 小结与讨论本论文初步研究了竹叶提取物中总黄酮的抑菌及其杀菌效果，以及竹叶提取物的水解处理产物的抑菌及其杀菌效果，并就两种药品的抑菌杀菌效果进行对比。结果表明：竹叶提取物和提取物水解产物对本次试验的大部分菌均有抑菌效果，反映出竹叶黄酮的抗菌谱还是比较广的，其中竹叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌杀菌效果很明显，提取物水解产物对藤黄微球菌的抑菌杀菌效果最为明显，最低抑菌浓度低于3.906mg/mL，最小杀菌浓度为7.8125mg/mL。该实验结果表明竹叶黄酮苷的抑菌杀菌效果和
18、其水解产物黄酮甙元相比，黄酮甙元的抑菌活性要略强于黄酮苷。竹叶黄酮现在在很多食品中都得到了应用，其中安吉的个个健竹饮料就是一种竹叶黄酮饮料，还有资料显示竹叶黄酮应用于食品的防腐，都是利用了竹叶黄酮的抗氧化性、抑菌效果。如果能将竹叶黄酮水解产物应用于各种抑菌杀菌方面，将是对竹叶提取物开发利用的一大贡献。参考文献1 刘晓蓉. 淡竹叶提取物抑菌防腐作用的研究J. 广东轻工职业技术学院学报, 2008, 7 (2): 20-23.2 冯涛, 曹东旭, 吕晓玲. 竹叶总黄酮含量的测定J. 中国食品添加剂, 2002, (6): 85-88.3 刘江, 周荣琪. 竹叶提取物总黄酮含量测定方法的改进J. 食
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