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1、实验五 细菌的单染色和革兰氏染色,目 的 要 求,学习对细菌的涂片、染色和无菌操作技术。了解染色原理、学习并掌握单染色和革兰氏染色技术。,实 验 原 理,细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，染色后，菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。微生物学中常用的是单染色法和革兰氏染色法。,单染色法：是用一种染料使细菌着色以显示其形态，不能辨别细菌细胞的构造，通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红 等）使其着色。当在中性、弱碱性、弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷。而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。,G+
2、：细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。G：细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。,革兰氏染色法：是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。,实 验 材 料,菌种：E.coli（大肠杆菌）、B.subtilis（
3、枯草芽孢杆菌）试剂：石炭酸复红染色液、革兰氏染色液(草酸铵结晶紫、碘液、95%乙醇、沙黄/番红染色液）其他：显微镜、载玻片、生理盐水、酒精灯、接种环、吸水纸、擦镜纸等,实 验 程 序,一、单染色法：涂片干燥固定染色水洗干燥镜检（高倍镜、油镜）,二、革兰氏染色：涂片干燥固定结晶紫初染水洗碘液媒染水洗酒精脱色水洗沙黄复染水洗干燥镜检,1.先将载玻片洗净，擦干。2.涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，按无菌操作法取大肠杆菌涂片，做成浓菌液，注意取菌不要太多。3.晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。4.固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。,
4、5.染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。6.水洗：用水洗去涂片上的染色液。7.干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。8.镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。,单染色法,1.涂片-干燥-固定 2.初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1-1.5分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4.脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约25秒左右，后立即用流水冲洗 5.复染：滴加番红染色液，染1-1.5
5、分钟，水洗后用吸水纸吸干。6.镜检：观察染色结果并绘图。,革兰氏（Gram）染色法：,1、用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。2、打开光源，调节光亮度 3、低倍镜观察：粗调、细调 4、依次再进行中倍、高倍观察 5、油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。6、换片：另换新片，必须从第三条开始操作。7、用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。,显微镜（油镜）的使用：,1.涂片不可太厚。2.固定时不能在火上烤的时间太长，否则菌体收缩变形。3.染色后必须晾干后才能用油镜镜检。4.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。5.菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。6.不要图片太厚，会造成假阴性或假阳性。,染色中注意事项：,1你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？2 涂片用的玻璃片为什么不得有油污？为什么涂片要求菌膜要均匀、薄？3 革兰氏染色的原理、依据是什么？,结果与思考题,
