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1、,3 微生物代谢调节,第二节 微生物次级代谢,初级代谢与次级代谢定义：初级代谢：为生物提供能量、合成中间体及其关键大分子，如Pr、核酸等的各种相互关联的代谢网络(包括分解与合成)。次级代谢：主要涉及合成过程，其终产物、次级代谢物对菌生长不是必需的，对其生命活动可能具有某种意义，通常在生长后期开始形成。,次级代谢物：也曾被称为分化代谢物(idiolites)、特殊代谢物。分化代谢物是指在最低培养基上给突变株提供次级代谢物的前体才能形成的。,微生物产生的次级代谢物有：,抗生素色素生物碱毒素,、种类繁多，结构特殊，含不常见化合物：,一、微生物次级代谢的特性,例如：氨基糖、苯醌、香豆素、环氧化合物、麦
2、角生物碱、戊二酰胺、吲哚衍生物、内酯、萘、核苷、杂肽、吩嗪、聚乙炔、多烯、吡咯、喹啉、萜烯、四环类抗生素等；,、含有少见的化学键：,例如：-内酰胺环、聚乙烯和多烯的不饱和键、大环内酯的大环和含有普通AA和经修饰的AA组成的环肽等；,、一种M所合成的次级代谢物往往是一组结构相似的化合物。,举例：产黄青霉能产生5种具有相同母核、不同侧链的天然抗生素，结构上的差别使它们具有不同的生物活性。组分的比例取决于遗传和环境因素，这是由于参与次级代谢物合成的酶的专一性不强所致；,、一种微生物的不同菌株可以产生分子结构迥异的次级代谢物。例如：灰色链霉菌可生产链霉素、白霉素、吲哚霉素、灰霉素、灰绿霉素和灰争霉素等
3、；,、不同种类的微生物亦能产生同一种次级代谢物.例如：如产黄青霉、点青霉、土曲霉、构巢曲霉、发癣霉属的一些真菌都能产生青霉素；,、次级代谢产物的合成比生长对环境因素更敏感。,例如：生长可在0.3300 mmol/L磷酸盐浓度下进行，而次级代谢物合成的最适浓度为0.110mmol/L。,研究微生物次级代谢的意义：,二、次级代谢物的生物合成,获得与次级代谢有关的基础理论知识，并用于设计更为有效的途径来合成这类复杂的化合物或改造它们，以获得所需的生物性质；有助于优化次级代谢产物的工业生产。借助于生物合成途径的知识，利用基因工程技术可以帮助构建在遗传学上能产生新化合物的突变株。,次级代谢物生物合成步骤
4、：养分摄入；通过中枢代谢途径养分转化为中间体；次级代谢物前体的生物合成；如有必要，改变其中的一些中间体；前体进入次级代谢物生物合成专有途径；次级代谢的主要骨架形成后作最后的修饰，成为产物。,1、前体的定义,（一）、前体的概况和来源,前体现代定义：指加入到发酵培养基中的某些化合物能被M直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。,中间体：指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质，它们均被进一步代谢，最终获得该途径的终产物。,前体与中间体的区别：前体的结构往往略需改变后才进入到代谢途径中去；有时指同一物质。,次级代谢物前体的种类：,Betina认为，次级代
5、谢物的前体大多数源自初级代谢的中间体：,、糖类；、莽草酸和(或)芳香AA；、非芳香AA；、C1化合物；、脂肪酸(尤其是乙酸和丙酸)；、TCA环的中间体；、嘌呤和嘧啶。,Martin等将可作为次级代谢物前体的初级代谢的中间体分为：,、短链脂肪酸；、异戊二烯单位；、AA；、糖与氨基糖；、环己醇与氨基环己醇；、脒基；、嘌呤与嘧啶碱；、芳香中间体与芳香AA；、甲基(C1库)。,次级代谢物的生物合成过程除了在前体的形成和聚合过程外，遵循一般的生物合成规律。次级代谢途径同初级代谢的分解代谢、无定向代谢和组成代谢紧密相关。其前体通常是正常的或经修饰的初级代谢的中间体。,小结：,（1）养分转化为中枢途径的中间
6、体,2、前体的来源,糖经分解代谢反应转化为较小的5-C，4-C，3-C和2-C单位(如戊糖，丁糖，丙糖，乙酸盐，-KG，OXA等)。有些中间体可直接用作前体。但有些需经修饰才能作为前体。,（2）芳香中间体,A 莽草酸途径的中间体或终产物：形成许多次级代谢物的芳香部分。B 芳香氨基酸生物合成途径：负责大多数放线菌和许多植物次生代谢物的生物合成。C 聚多酮途径：大多数真菌产生的芳香代谢物是由乙酸通过聚多酮途径合成的。,举例：、氯胺苯醇和棒杆菌素的生色团是由分枝酸衍生的。、利福霉素的芳香成分来自莽草酸。、绿脓菌素的吩嗪骨架源自邻氨基苯甲酸。、新生霉素和黄青霉素的芳香部分来自酪氨酸。、放线菌素、吲哚霉
7、素、硝吡咯菌素的芳香环源白色氨酸。,（3）经修饰的糖前体,、氨基糖苷类抗生素：其糖大多数来自葡萄糖，其碳架以整体方式结合到抗生素中。但往往需要经过修饰或转化。糖的修饰：差向异构化，异构化，氨化，去羟基，重排(生成分枝糖)，脱羧，氧化和还原。糖的转化：以核苷二磷酸衍生物，如UDP-葡萄糖形式进行。UDP-葡萄糖由葡萄糖-1-P的葡萄糖基转给UTP获得。,、大环内酯类抗生素的糖的生物合成：是以TDP-衍生物作为中间体形式进行的。、己糖胺的形成：是通过己酮糖和谷氨酰胺的转氨作用完成的。,、有些次级代谢物完全由糖组成(如氨基环多醇抗生素)；另一些糖以糖苷的形式存在于次级代谢物中。,举例：,TDP-葡萄
8、糖衍生物是泰乐菌素生物合成的中间体。UDP-葡萄糖参与新生霉素的生物合成。CDP-葡萄糖则参与核苷类抗生素。有些抗生素带有甲基化糖。,（5）甲基的来源 抗生素生物合成中的所有甲基化作用均以Met作为甲基供体，通过甲基转移酶进行。而Met的甲基源自N5-四氢叶酸。转甲基时Met先活化，即在Mg2+和ATP存在下生成高能甲基供体：S-腺苷酰甲硫氨酸(SAM)。以SAM进行甲基化后自己变成S-腺苷酰高半胱氨酸(SAH)，后者可被水解为腺苷和高半胱氨酸。,（1）抗生素建筑材料,（二）、前体的作用,例如：丙酮酸可用于Ala、Val、Leu等的合成，是几种肽类抗生素（头孢菌素簇或青霉素簇）合成的重要中间体
9、。,次级代谢物通常由初级中间体产生，将初级中间体转化为次级终产物有三个生化过程：,、生物氧化和还原；、生物甲基化；、生物卤化。,、氧化还原反应：一般涉及醇的氧化或羰基的还原，双键的引入或还原，氧原子的引入和芳香环的氧化裂解，这些反应是由脱氢酶或加氧酶催化的。、生物甲基化是各种代谢物，特别是聚酮化物的生物合成中的重要反应。、卤化作用对分子中含卤元素(大多数是氯)的次级代谢物是很重要的。,其特征如下：,许多次级代谢物是用不同的中间体作为建筑单位合成的。,例如：、大环内酯类抗生素：其糖苷配基是由脂肪酸衍生的，其糖部分是由葡萄糖衍生的。、真菌毒素和橘霉素：是由五个C2单位(Ac-CoA加上4个丙二酰C
10、oA)，2个甲基和由C1库来的羧基合成的。、新生霉素：具有更为复杂的来源，它是由葡萄糖、莽草酸、GLN、C1库、Tyr和乙酸或Leu合成的。,（2）诱导抗生素生物合成 前体具有调节抗生素生产的作用，尤其在细胞中的特殊合成酶的活性已被激活的情况下。,例1：在带小棒链霉菌中头霉素C的一种前体，-氨基己二酸是由赖氨酸合成途径来的。它与Pr合成竞争此前体的供应。加入过量的Lys，Lys途径中间体，二氨基庚二酸或-氨基己二酸到发酵液中可增加头霉素的发酵单位。,例2：产黄青霉的青霉素酰基转移酶可转化异青霉素N，除去青霉素N的侧链，换上天然青霉素的其他侧链。侧链的置换取决于发酵液中含有适当的前体，如苯乙酸或
11、苯氧乙酸11则。故苄青霉素的发酵单位随发酵液中的限制性苯乙酸的增加而提高,例3：L-Val被认为是环孢菌素A的前体和生物合成的诱导物。加入Val可促进Tinflatum固定化细胞合成环孢菌素A。例4：赤霉素受葡萄糖的阻遏。这可通过加入3-甲基-3,5-二羟基戊酸克服。,例5：丙醇和丙酸具有促进红霉素生产的作用，丙酸的作用稍差些。在发酵前期加入丙醇会干扰生长，从而降低抗生素的合成。先前认为，丙醇的促进作用完全是由于起前体的作用，现已清楚，除了作为前体外，它还能诱导红霉素链霉菌的AC-CoA羧化酶。此诱导作用似乎发生在转录水平，因在发酵中加入放线菌素D可以阻抑这种作用。,（3）前体与诱导物的区别,
12、诱导作用在次级代谢物的合成控制上起重要作用。有时难于区分这种促进作用是真的诱导物的作用还是前体的作用。,、诱导物与前体的作用时期不同。一般把那些能在生长期内生产期前促进抗生素生物合成的化合物看做诱导物，而前体往往只在生产期内起作用，甚至Pr合成受阻的情况下也行。,、诱导物应能被非前体的结构类似物取代。如Met除了可作为头孢菌素合成的前体，提供S的作用，更为重要的作用在于诱导节孢子的形成，而后者的多寡影响头孢菌素的合成。Met可被Leu取代。、诱导物的另一个特征是其诱导系数特别高。如诱导链霉素形成的A因子，其诱导系数为106。,（三）、前体的限制性,前体常常是次级代谢物生物合成的限制因素。例1：
13、在发酵过程中加适量苯乙酸可强烈促进苄青霉素的生产；例2：丙酸或丙醇促进大环内酯抗生素的生物合成。,例3：肽类抗生素的形成中非蛋白的AA成分通常是限制因素。例4：缺少Ac-CoA会限制四环素的生产。例5：金色链霉菌低产菌株的特征是Ac-CoA倾向于走TCA循环而被氧化；高产菌株没有这一倾向。例6：诺尔斯链霉菌合成制霉菌素的能力的提高与其前体，丙二酸和甲基丙二酸合成的增加有关。,（1）前体合成的分子调节机制 如初级代谢和次级代谢均需要同一种必需的前体，则低浓度的前体需先满足生长的需要。例1、这在抗生素链霉菌的营养缺陷型的放线菌素生产中获得证实。AA营养缺陷型所需的AA正好是放线菌素的组成部分时，这
14、种营养缺陷型必然是低产菌株。例2、低浓度的氯化物限制含氯的抗生素，灰黄霉素的生产。,高浓度的前体是抗生素合成所必需的，除去前体生物合成的反馈调节机制有可能使抗生素增产。,例如：金黄色假单孢菌的耐Trp结构类似物的突变株的硝吡咯菌素高产原因是由于促进所需前体，色氨酸的生物合成。,（2）前体导向抗生素的合成,次级代谢物的前体源自初级代谢，前体叉向次级代谢物合成途径的第一个酶往往是关键。因为：它决定前体流向抗生素合成的数量，其代谢流的分布和抗生素的产量。途径中可能存在其他限制性酶。这些酶往往受到反馈、碳、氮或磷的调节。另一些酶可能受到高浓度前体的诱导。,引向初级和次级代谢物的支路途径的生理调节随不同
15、的M及其代谢途径而有所不同。例如：莽草酸途径的关键中间体分枝酸在初级代谢中一方面引向Phe和Tyr；另一方面导向对-羟苯甲酸和对-氨基苯甲酸；另一分枝途径形成各种吩嗪(phenazine)次级代谢物和Trp。,（3）添加前体的策略,研究前体添加策略对有些抗生素高产稳产有重要意义。举例：青霉素G生产需要加入苯乙酸或苯乙胺，发酵培养基中常用玉米浆的原因之一是这种原料含有苯乙胺。苯乙酸具有促进青霉素生物合成的作用，可在基础料中和过程中添加，其理论用量为0.47g苯乙酸/g青霉素G；0.50g苯乙酸/g青霉素V。实际用量应考虑利用率。高产菌株对前体的利用率(可90)比低产菌株高许多。,添加前体时宜少量
16、多次或流加，控制发酵液中前体的残留浓度在适当范围。例如：苯乙胺浓度在0.050.08。,前体一旦合成，便流向次级代谢物生物合成的专用途径。在某些情况下单体聚合成聚合物，如聚多酮、寡肽和聚醚类抗生素等。这些特有的生物合成中间产物需作后几步的结构修饰，进行的深度取决于产生菌的生理条件。有些复杂抗生素是由来自不同生物合成途径的几个部分组成的。,（四）、把前体引入次级代谢物生物合成的专用途径,了解这方面所涉及的生物合成酶很重要，尤其是专用途径的第一个酶，因它决定了前体进入次级代谢物合成途径的通量、中间体的流向和途径的生产能力。途径的其他关键酶也可能是控制步骤，这类酶常受碳、氮分解代谢物的阻遏以及磷和反
17、馈调节。其中有些酶可能受胞内积累的高浓度前体的诱导。,例如：二甲基丙烯基色氨酸(DMAT)合成酶(麦角生物合成第一个酶)，苯恶嗪酮(phenoxazinone)合成酶(形成放线菌素苯恶嗪酮生色团的酶)，脒基转移酶(L-Arg，磷酸肌糖胺脒基转移酶，是链霉素链霉胍部分的生物合成的关键酶)，鸟苷三磷酸-8-甲酰水解酶(催化吡咯嘧啶核苷类抗生素的吡咯环)，对氨基苯甲酸合成酶(把分枝酸转化为对氨基苯甲酸，是杀假丝菌素生物合成的第一个特异性酶)（参阅表3-4）。,次级代谢专用的关键酶通常受次级代谢物的控制：例1：麦角生物碱生物合成的第一个酶受Trp或其类似物的诱导作用。从生长期到生产期的过渡期间较高的T
18、rp库存量导致DMAT合成酶的浓度增加。例2：苯恶嗪酮合成酶是放线菌素生物合成的关键酶，受葡萄糖分解代谢物阻遏。例3：磷酸阻遏灰色链霉菌的对氨基苯甲酸合成酶的形成。,通过前体单体聚合的次级代谢物有：四环类、大环内酯类、安莎霉素类、真菌芳香化合物的聚多酮类和肽类抗生素，以及聚醚和聚异戊二烯类抗生素。这些聚合过程所涉及的生物合成机制对上述次级代谢物均适用。这说明这类合成酶具有共同的进化渊源。,（五）、前体聚合作用过程,聚合反应是由高相对分子质量的合成酶催化的：,例如：肽类抗生素合成酶 聚多酮合成酶,聚合后许多次级代谢物的化学结构通过多步酶反应修饰完成。,（六）、次级代谢物结构的后几步修饰,例1：在
19、四环类抗生素生物合成中聚合的九酮化物中间体通过闭环转化为6甲基四环化物，后者经几步转换，包括C-4的氧化，C-7的氯化(金霉素合成的情况下)，C-4的氨化，随后在氨基上的甲基化和在C-6上(金色链霉菌)、C-5上(龟裂链霉菌)的羟基化。,例2：红霉素生物合成的最后几步(即红霉内酯形成后)为连接两个脱氧糖，和这些糖的O-甲基，N-甲基或C-甲基化。,例3：头孢菌素生物合成的最后几步为去乙酰氧头孢菌素C(经闭环和扩环步骤产物)被羟基化为去乙酰头孢菌素C。,某些次级代谢物是由单一类前体衍生的，（例如同型肽）。许多次级代谢物由几类不同的前体合成的。（例如，杂肽类抗生素是由氨基酸和脂肪酸组装成的）。,（
20、七）、复合抗生素中不同部分的装配,例1：在缩酚(depsi)肽抗生素中AA与羟酸连接。例如，缬氨霉素含有乳酸和2-羟异戊酸(图3-14.)。,例2：链霉素、诺卡菌素A、杀假丝菌素和新生霉素是由几种不同前体组装的典型抗生素。、链霉素：由N-甲基-L-葡萄糖胺、链霉糖和链霉胍三部分组成。、新生霉素：由新生霉糖、香豆素、对氨基苯甲酸和异戊烯四个部分组成的。、杀假丝菌素：由对氨基苯甲酸与4个丙酸，15个乙酸和一个丁酸单位缩合组装的，并连接上一个罕见的碳霉糖胺。,、诺卡菌素：由L-高丝氨酸、修饰过的L-对羟苯甘氨酸、L-Ser和未经修饰的L-对羟苯甘氨酸组成。,次级代谢物合成酶往往只具有簇的专一性，即对
21、基质分子的某一部分有要求，对分子的其他部分无绝对要求。,（八）、次级代谢物合成酶的专一性,例如：产黄青霉的青霉素酰基转移酶能催化青霉素N的a-氨基己二酰侧链，使转化为疏水性的酰基侧链。此反应的专一性较高，因它不能酰化7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)，但接受广泛的内源与外源酰基CoA衍生物。,参与初级代谢物和次级代谢物生物合成的基本差别之一在于引物和延长单位的异质性。例如：如由于缺少高度专一性，乙酰CoA、丙二酰CoA和丙二酰胺CoA可在四环类抗生素合成中作引物。同样，杀假丝菌素合成中几种芳香酰基CoA衍生物也可作引物。例如：大环内酯生物合成中的延长单位有丙二酸、甲基丙二酸和丁酸。,然而，不是所
22、有参与次级代谢物合成的酶都缺乏基质专一性。有些具有高度专一性。例1：红霉素合成酶形成红霉内酯糖苷配基时只接受甲基丙二酰CoA作为延长单位，而不用丙二酰CoA单位。杀假丝菌素合成酶总是按既定的顺序聚合适当的前体单位。,通过基因操纵可以改变次级代谢物合成酶的专一性。其突变株常能形成特殊的次级代谢物，形成新的终产物。,第三节 代谢工程,代谢工程(metabolic engineering)是指藉某些特定生化反应的修饰来定向改善细胞的特性或运用重组DNA技术来创造新的化合物。代谢工程的要素：将分析方法运用于物流的定量化，用分子生物技术来控制物流以实现所需的遗传改造。,3.3 代谢工程,代谢工程所采用的
23、概念来自反应工程和用于生化反应途径分析的热力学。它强调整体的代谢途径而不是个别反应。代谢工程涉及完整的生物反应网络、途径合成的问题、热力学可行性、途径的物流及其控制。要想提高某一方面的代谢和细胞功能应从整个代谢网络的反应而不是一个个反应去考虑。重点应放在途径物流的放大和重新分配上。,想通过单个酶的超表达来提高代谢途径的物流是行不通的，除非此酶具有高的物流控制系数。假定能成功超表达途径受限制的酶，该酶固然不再受反馈抑制，但瓶颈可能落在途径下游的酶上，从而导致代谢中间体的大幅度的增加。同时和协调地超表达途径中的大多数酶，原则上可大大提高代谢物流而不至于改变各代谢物的浓度。另一种选择是增加途径产物的
24、需求，这或许可通过提高产物的分泌速率办到。,对代谢和信息途径的性质，它们的相互作用及其物流的控制了解得很少。这方面的了解对于运用重组DNA技术和与应用分子生物学有关的方法来合理修饰途径是必需步骤。,有关术语：途径(pathway)：指催化总的代谢物的转化，信息传递和其他细胞功能的酶反应的集合。物流(通量)(flux)：指物质或信息通过途径被加工的速率，它与个别反应速率不同。代谢物流分析：一种计算流经各种途径的通量的技术，用于描述不同途径的相互作用和围绕支点的物流分布。,3.3.1 代谢通量的概念,代谢控制分析(metabolic controlanalysis)的概念认为，物流控制被分布在途径
25、的所有步骤中，只是若干步骤的物流比他的更大些，可用数学方程来描述反应网络内的控制机制，即用一途径的物流和以物流控制系数来定量表示酶活之间的关系。物流控制系数(flux control coefficient，FCGs)是系统的性质，大体上可用物流的百分比变化除以一酶活(该酶能引起物流的改变)的百分比变化表示。,物流求和理论(flux summation theory)是如果将一代谢系统中的某一物流的所有酶的物流控制系数加在一起，其和为1。弹性系数(elascity coefficients)表示酶催化反应速率对代谢物浓度的敏性。弹性系数是个别酶的特性。物流分担比(flux split rati
26、o)是指途径A与途径B之比，如葡萄糖-6-磷酸节上的物流分担比便是EMP途径物流/(pp途径物流)。敏感性系数是个别酶的特性，表示酶催化反应速率对代谢物浓度的敏感性。,代谢工程可用于以下几个方面：改进由M合成产物的得率和产率；扩大可利用基质范围；合成对细胞而言是新的产物或全新产物；改进细胞的普通性能，如耐受缺氧或抑制性物质的能力；,3.3.2 代谢工程的应用,减少抑制性副产物形成；环境工程方面；药物合成方面，作为中间体的手性化合物的制备；在医疗方面用于整体器官和组织的代谢分析，用于鉴别藉基因治疗或营养控制疾病的目标；信息传导途径方面，即信息流的分析，为了治疗疾病而进行基因表达的分析和调节，需了
27、解信息流的相互作用和控制。,代谢物流的定量是代谢工程的重要分析技术，尤其与代谢物的生产研究有关，其目标是使尽可能多的碳从基质流向代谢产物。代谢物流分析是一种定量计算通过各种途径的物流的强有力的技术。,3.3.3 代谢(物)流分析,用于代谢物流分析的方法是一种适用于所有主要胞内反应的化学计量模型和围绕胞内代谢物的物料平衡。输入到计算中 是一套测量的物流，典型的有基质吸收速率和代谢物的分泌速率。如用富集C13的碳源做试验和测量胞内代谢物富集的C13部分再加上一套模型的限制条件，便可如愿地测量胞内物流。最后，还可将有关同位素分布的信息用于获得更多有关胞内代谢物的信息。,尽管物流分布的测量可提供有用信
28、息，它只代表物流怎样分布与细胞的点滴见解。不同的操作条件和不同的突变株中首次测得的物流分布可提炼出宝贵的信息。如鉴别了物流分担比(flux split ratio)和产率间的相互关系。产黄青霉的青霉素生产分析中作者发现在6-磷酸葡萄糖节(结，node)上的物流分担比与基于葡萄糖的青霉素得率之间的相互关系（表3-8）。这种相互关系表现在青霉素的生产需要大量的NADPH(尤其是前体，L-Cys)。,代谢物流分析的应用：（1）定量各途径物流和测量流入细胞内的碳（2）鉴别细胞途径中的刚性分支点(节点)通过比较不同突变株和不同操作条件下各途径的物流分布可以鉴别途径的节点是刚性还是柔性。通过几种突变株的代
29、谢物流分析，得出以下结论：Lys生产的6-磷酸葡萄糖节点是柔性的，而丙酮酸节点是弱刚性的。,（3）不同途径存在的鉴别 用公式表示反应化学计量关系是代谢物流分析的基础，它需要知道与生化有关的详细信息。但对许多M代谢途径的某些化学计量细节，途径是否具有活性知道得很少。对有些细胞的同功酶的功能也不十分了解。通过计算不同细胞途径的代谢物流可鉴别哪些途径很可能存在，并获得有关同功酶和(或)途径功能的信息。通过酿酒酵母厌氧生长的分析发现醇脱氢酶是一种线粒体酶，其功能还未鉴别，在维持线粒体内的氧还电位起重要的作用。,（4）非测量所得的胞外物流的计算 一般，可测量的物流数目多于需用于计算胞内物流的数目。在这种
30、情况下有可能计算若干胞外物流，例如用化学计量模型和测得的物流计算几种胞外副产物的生产速率。,（5）考察另一些途径对物流分布的影响 关于代谢物生产的优化，可鉴别一种或几种提高代谢物得率或导向所需代谢物通量的限制作用。为此，可做一些设想，如插入一条新途径或同功酶(或将其消除)是否具有消除该限制的积极效果，从而引起所需物流的增加。在研究青霉素的生产方面Jorgensen等求得在青霉素前体，Cys由直接巯化作用比通过转硫途径合成的青霉素的得率更高。,（6）最大理论得率的计算 基于化学计量模型，如已知各种限制条件，便可以计算一已知代谢物的最大理论得率。此值对揭示过程得率的上限有用。此模型曾应用于棒状杆菌
31、的Lys和产黄青霉的青霉素生产上，求得不同比生长速率下的最大青霉素理论得率，并发现，当比生长速率从0提高到0.05h-1时，理论得率急速下降。比生长速率0.025 h-1的条件下其得率三倍于在高产菌株所能得到的。,代谢工程的一个最为重要的方面是物流的控制。如上面所述，代谢物流分析(MCA)概念只是对不同途径的相互作用的研究和围绕支点的物流分布的定量有用，但无法评估物流怎样得到控制，即代谢物的合成与转化速率如何在外部条件变化很大的情况下保持严密的平衡，而不至于引起代谢物的浓度灾难性地升高或下降。,3.3.4 代谢控制分析,20世纪50年代，反馈抑制、协同作用、酶的共价修饰和酶合成控制的发现，引入
32、一些可能对控制物流有一定作用的分子效应。早期的发现认为，途径的第一个酶，分支后的第一个酶往往是速率限制步骤，受到某种类型的调节，如反馈抑制作用。,代谢控制分析概念则认为这类定性的观点没有多大意义，因物流控制被分布在途径的所有步骤中。只是若干步骤的物流量比其他的更大些。虽然并不排斥其中一种酶的物流控制系数可能达到1，但考虑到途径的其他的酶也要分享此物流控制系数，因此，这些酶中没有一个是真正速率限制性的。,物流求和理论还阐明，一个酶的物流控制系数不是哪个酶单独固有的而是系统所具有的性质。当酶Exase的活性从很低的水平提高到很高的水平，其物流控制系数也会改变。显然，若此物流控制系数在改变，则其他酶
33、的活性虽然未变，其物流控制系数也会改变。这是因为不管Exase在哪一水平，途径中的所有酶的物流控制系数之和等于1。这明显是一种相互作用，其他一些酶量的变化也会引起Exase的物流控制系数的改变。,物流控制分析的概念是由Kacser等和Heirich等首先提出的。其基础为一套参数，称为弹性系数(elascity coefficients)和控制系数(control coefficient)，它们以数学来描述反应网络内的控制现象。弹性系数jxj可用式(3-1)表示。它表示酶催化反应速率vi对代谢物浓度(Xj)的敏感性。,最为常用的控制系数是物流控制系数(FCCs)，可用式(3-2)表示,FCCs表
34、示通过途径的稳态物流的部分变化。它来自酶活(或反应速率)的无穷小的变化。FCCs与弹性系数通过求和理论(summation theorem)相互关联。求和理论认为所有FCCs之和等于1，而联系理论(connective theorem)认为弹性系数乘积与FCCs之和等于零。,测量FCCs的方法可分为以下几组：直接法，可用于直接测量控制系数；间接法，可用于测定弹性系数和藉MCA理论求得控制系数；瞬变代谢物测量，在瞬变期间测量代谢物浓度，所得信息可用于测量控制系数。,表3-9(pp96)列出各种直接和间接测量FCCs方法。有人认为，除非试验数据采用双曲线回归分析法评估，没有一种试验方法能得出满意的
35、结果，实际的物流对酶活作曲线呈双曲线形式。反之，MCA应基于能直接计算FCCs和弹性系数的动力学模型。因试验技术不能得出准确的MCA系数，一些途径的代谢控制分析结果不能作为最终的结果，只能作为一种指示，例如，阐明物流控制在途径中是怎样分布的。,弹性系数是个别酶的特性，FCCs是系统的性质。因而FCCs不是固定的，随环境条件而变。通过途径的各种酶的动力学模型可求得不同补料分批培养阶段的FCCs，发现物流控制方面剧烈波动。,以青霉素合成为例，在培养的第一阶段物流控制主要在途径的头一步，即由ACV合成酶(ACVS)形成三肽，LLD-ACV。随后培养物流控制移到途径的第二步，即由异青霉素N酶(IPNS
36、)将LLD-ACV转化为异青霉素N。这种物流控制的移动是由于胞内聚积了LLD-ACV，这是ACVS的抑制剂。显然，在此提出速率限制步骤或瓶颈的说法是没有意义的。除了物流控制的波动，途径中的物流控制大多数是由头两部实现的。此外，通过模型的分析发现，FCCs值取决于溶氧浓度，它是IPNS催化反应的一种基质。,物流控制系数可作为预测的工具。代谢控制分析的理论和实践阐明真正限率酶不存在。具有最大物流控制系数的酶对途径物流影响最大，故用控制分析的理论和试验手段来鉴别一代谢系统中哪一个酶具有这种特征是合理的。那么，这种酶便是作用靶位，提高其活性会导致途径物流增加。代谢控制分析的理论或试验均不支持鉴别速率限制步骤的传统方法。特别是位于途径初始的，受途径反馈抑制的变构酶，是一种具有很小物流控制系数的非速率限制性酶。,本章结束，谢谢！,
